Прохождение через точку старта зависит от протеинкиназы, родственной М-стимулирующему фактору

(MPF) [15]

Дрожжи с их быстрым размножением и простой одноклеточной организацией - привлекательный объект для генной инженерии, и их легко использовать для включения ДНК, добавляемой в питательную среду. В принципе это позволяет клонировать нормальную («дикого типа»)

форму любого из генов cdc. Как показано на рис. 13-21, интересующий нас клон может быть без труда выделен благодаря его способности избавлять соответствующего мутанта cdc от его аномалий.

Такой подход был использован для клонирования гена cdc28 почкующихся дрожжей и гена cdc2 делящихся дрожжей; при этом было обнаружено несколько удивительных соответствий между этими двумя типами дрожжей и между дрожжами и позвоночными в отношении контроля точки старта и митоза. Гены cdc2 и cdc28 у дрожжей гомологичны и по последовательности нуклеотидов, и по функции: у делящихся дрожжей с мутацией гена cdc2 функциональный дефект можно устранить путем введения гена cdc28 от почкующихся дрожжей. Более того, у тех же мутантов по cdc2 сходного результата можно достичь, вводя им клонированный фрагмент ДНК человека, в которой, оказывается, тоже имеется последовательность, гомологичная cdc2/28. По-видимому, этот компонент механизма, управляющего клеточным циклом, является общим для дрожжей, млекопитающих и, вероятно, всех других эукариот.

Имея клонированный ген cdc2/28, сравнительно легко выделить белок, кодируемый этим геном. Он представляет собой протеинкиназу и, судя по всему спектру структурных и функциональных критериев, видимо, является дрожжевым гомологом киназной субъединицы MPF позвоночных. Кроме того, клонирование гена показало, что другой ген cdc делящихся дрожжей-cdc 13, продукт которого взаимодействует с продуктом гена cdc2, в высокой степени гомологичен гену циклина (разд. 13.1.11). Эти данные показывают, что MPF и циклин, вероятно, имеют универсальное значение в клеточном цикле эукариот; а двойственная роль cdc2/28 у дрожжей - в начале М-фазы и в точке старта - позволяет предположить, что у позвоночных соответствующая субъединица MPF или близкая к ней молекула тоже может каким-то образом участвовать в контроле инициации цикла деления во время фазы G1.

Рис. 13-21. Метод выделения генов cdc из библиотеки ДНК. Клон редкой ДНК, содержащей нормальную копию дикого типа определенного гена cdc, легко отобрать, так как содержащая его плазмида делает соответствующую мутантную клетку неспособной расти при высокой температуре. И ген cdc2 делящихся дрожжей, и ген cdc28 почкующихся дрожжей первоначально были выделены таким способом.

Повторяя эту процедуру с клонами кДНК из библиотеки ДНК человека в подходящей плазмиде, удалось выделить гены человека, способные заменять некоторые гены cdc дрожжей.

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

В самом деле, исследования на делящихся дрожжах показывают, что изменения в состоянии фосфорилирования этой регуляторной молекулы могут быть тем механизмом, с помощью которого клетки координируют свою готовность к началу цикла деления с условиями среды.

Заключение

Дрожжи - одноклеточные эукариотические организмы, очень подходящие для генетического анализа. И у почкующихся, и у делящихся

дрожжей было идентифицировано множество мутаций, затрагивающих цикл клеточного деления (cdc), и клонированы соответствующие гены

дикого типа. У дрожжевых и многих других эукариотических клеток, несмотря на изменчивые условия питания, поддерживаются стандартные

размеры клетки с помощью механизма, который препятствует прохождению клетками критической точки (называемой точкой старта) и

запускает цикл деления, когда они достигают пороговых размеров. У дрожжей некоторые из ключевых генов cdc, участвующих в этом контроле, были идентифицированы и их нуклеотидные последовательности определены. Один из них (обозначаемый cdc2 у делящихся дрожжей и cdc28-y

почкующихся дрожжей) кодирует протеинкиназу, гомологичную MPF; другой ген (cdc!3) кодирует дрожжевой гомолог циклина.

Дата добавления: 2015-08-31