Трансгендік жануарлар

Полимеразды-тізбекті реакция

Полимеразды-шынжырлы реакция (ПЦР) – in vitro жағдайында ДНҚ тізбектерінің көп санын жасауға арналған реакция. ПЦР өткізу үшін келесі химиялық компоненттер болу керек: синтетикалық олигонуклеотидтық үлгілер (20 нуклеотидтен әр біреүі), ДНҚ-полимераза, төрт дезоксирибонуклеотид.

Жұмыстардың бәрі автоматика көмегімен өткізіледі. Бір цикл 3-5 минут созылады.

ПЦР – циклды үдіріс, үш кезеңді өтеді:

Денатурация. ДНҚ үлгісін 95 градуска дейін жылыту. Реакция 1 минут жүреді.

Ренатурация. Қоспаның температурасы ақырындап 55 градусқа дейін суытылады. Нуклеотидтық паралар жаратылады.

Синтез. Температура 75 градуска көтеріледі. ДНҚ-полимераза жұмыс істеуге қолайлы жағдай тұдырылады. ДНҚ синтезі басталады.

ПЦР – молекулярлы биотехнологияда кең таралған процедура. Адамның, жануарлардың ағзаларында, өсімдіктерде патогендық генді сұрыптау үшін, мутацияларды табу үшін, синтетикалық олигонуклеотидтерден бүтін гендерді құрастыру үшін колданатын реакция.

Жасұшалы технологиялар мал шаруашылықта

Репродукция жасұшалар деңгейінде жануарлардың генотиптерін биотехнология әдістерімен ДНҚға (молекула деңгейінде реттеүмен), ядроға (ядро деңгейінде реттеүмен) немесе бластомераларға (жасұша деңгейінде реттеүмен) әсер етіп өзгертеді.

Молекулярлы деңгейде реттеүде трансгендық жануарларды трансгеноз әдісімен рДНҚмен қолданып алады. Ядролық микрожұмыстарда клондалған жануарларды алу мақсатымен ядроларды сома жасұшалардан бөліп алып жұмыртқа жасұшаларына көшіреді. Ал бүкіл жасұшаның деңгейінде микрожұмыстар өткізгенде ұрықтарға әсер етіп дисекция (бисекция) әдісінің көмегімен монозиготтық жануарларды алады немесе әр түрлі генотиптерге қатысты бластомераларды қосып химералық жануарларды алады.

Бір биологиялық жүйеден екінші биологиялық жүйеге гендерді жасанды тасу трансгеноз деп аталады.

Жануарлардың гаметаларымен және ұрықтарымен генетикалық жұмыстарды келесі биологиялық ерекшеліктер болғандықтан өткізеді:

1. Жануарлардың молекулярлы деңгейде ерекшеліктері – геннің негізгі қасиеттері.

2. Жануарлардың жасұшалы деңгейде ерекшеліктері – гаметогенез, ұрықтану, ұрықтың имплантация алдындағы дамуы. Суперовуляция әдісінің көмегімен ооциттердің керекті санын алуға болады. Экстракорпоралдық ұрықтану әдісінің көмегімен зиготалар алып генно-инженериялық құралымдарды еңгізеді. Ал ұрықтың имплантация алдындағы дамуы культивирлеу әдісін тұдырды. Қайта отыртуға тек қана биологиялық толық зиготалар және ұрықтар алынады, сондықтан трансплантацияға культивирлеу әдісімен трансгеноздан жақсы шығып эмбриондар жаратқан зиготаларды алады.

Трансгендік жануарлардың сипаттамалары:

1. Геномға бөтен гендер интегратталу.

2. Инъекциядан кейін 5-20 пайыз зиготалар дамуға дайын.

3. Трансгендік жануарларды геномдарынан бөтен ДНҚ және бөтен геннің экспрессиясының өнімін (мРНҚ, рекомбинанттық ақуыз) тауып сұрыптайды.

4. Бөтен гендердің экспрессиясы ұлпаспецификалық сипаттамалар алып жүреді.

5. Еңгізілген бөтен геннің экспрессиясы жануарлардың фенотиптерін өзгертеді.

6. Трансгендік жануарлар бөтен генді ұрпақтарға береді.

Мақсатына байланысты трансгендік жануарларды екі дәрежеге бөледі:

1. Жаңа өнім алуға арналған трансгендік жануарлар, мысалы, медицинаға және малдәрігерлікке қажетті бағалы ақуыздарды синтездеу.

2. Бағалы селекциялық белгілері бар және жоғары төзімді трансгендік жануарлар.

Бірінші трансгендік жануар – тышқан – 1976 жылы алынған. 1986 жылы трансгендік қой, 1987 жылы ірі қара мал, 1989 жылы шошқа алынған. Трансгендік құстар және балықтар алынған.

Ауылшаруашылық жануарларды көбейткенде жаңа технологиялармен қолданған әдістерді еңгізеді. Әдістердің бірі – молекулярлы құралымдарды жануарлардың геномдарына кіргізу.

Трансгендік ауылшаруашылық жануарлар

Бүгінгі күнде ауылшаруашылық жануарларды көбейту жұмыстарында жаңа технологиялармен қолданады. Болашағы бар әдістердің бірі – молекулярлы құралымдарды жануарлардың геномына апару. Молекулярлы құралымдарды қолдану ұстанымдары келесі: рДНҚны ұрықтандырылған жұмыртқа жасұшасының ядросына апару, кейіннен сол жұмыртқа жасұшасын реципиенттің жатырына имплантация және геномында бөтен ген бар жануар туу үшін транспланттайды. Трансгендік жануарлардың негізінде жаңа генетикалық қатарлар алу жатыр.

Биотехнология әдістерін қолданғанда сүт өнімі 14 пайызға, ет өнімі 17 пайызға, жүн алу 12 пайызға өседі. Жануарларды клондағанда сүт өнімін 20-25 пайызға, ет алуды 30 пайызға, жүн алуды 20 пайызға, трансгенозда – 70-80 пайызға, 80-90 пайызға, 40-50 пайызға көтерүге болады.

Трансгенозда бөтен ген геномға 5 пайыз жағдайларда еңгізіледі. Трансгеноздан өткен 100 пайыз зиготалардан 66 пайызы биологиялық толықтығын сақтайды, 40 пайызы жатырға еңгізіледі, 25 пайызы туылады. 1000 еңгізілген зиготалардан 30-50 трансгендік жануарлар туады.

Кәзіргі уақытта трансгендік сиырларды келесі бағыттарда қолданады:

1) лактозаны қорыта алмайтын адамдарға арналған лактозасы жоқ сүт алу;

2) казеині көп сүт алып, сол сүттен сірне жасау;

3) фармакологияда моноклоналдық антиденелер алу.

Клондалған жануарлар

Клондау – алғашқы бір молекуладан, жасұшадан немесе дарақтан көп үлгілер алу процессі. Клондалған жануарларға бір дарақтан (немесе бір ұрықтан) шыққан генетикалық ұқсас ағзалардың тобын жатқызады.

Мал шаруашылық тәжірибеде «құрастырылған» жануарларды алу технологиясының екі түрі бар – түрдің ішінде және түрлердің арасында. Түрдің ішінде «құрастырғанда» клондалған, түрлердің арасында «құрастырғанда» - химералық жануарлар алынады.

Клондалған жануарларды алу екі әдісін айырады:

Имплантацияға дайындалған ұрықтың дисекция әдісі. Осындай әдіспен алған жануарларды монозиготтық егіздер деп атайды.

Энуклеарды жұмыртқа жасұшаларына сома жасұшаларынан алынған ядроны отырту.

Дисекция әдісі. Монозиготты жануарлар алу негізінде тотипотенттік (әр бір бластомераның ұрықтан бөлінгенде өмір сүре алатын тұқым беру қасиеті) жатыр, ал осындай әдіспен клондарды алу негізінде жануарлардың биологиялық ерекшеліктері жатыр – бір жұмыртқалы егіздерді табу.

Монозиготты жануарларды алу әдістемесі келесі процедуралардан тұрады.

1. Ұрғашы-донордың жыныс жолдарынан 2-8 бластомералық бөліну кезеңіндегі ұрықтарды алу.

2. Пеллюцид зонасын алу. Алу екі әдісін айырады: 1) микроманипулярлы құралдың астында механикалық бөлу; 2) фермент проназаның көмегімен ферментативтық әсер ету.

3. Ұрықты бөлек бластомераларға бөлу.

4. Бөлініп алынған бластомераларды энуклеардық жұмыртқа жасұшасына инъециялау.

5. Құрастырылған ұрықты агар цилиндіріне кіргізу. Агар ұрғашының жыныс жолында ерімейді, ұрыққа дамуға жағдайлар тұылады.

6. In vivo культивирлеу.Ұрықты агармен бірге реципиенттің жұмыртқа жолына кіргізеді. Реконструкциядан өткен ұрықтарды культивирлеу үшін реципиент ретінде қойлармен қолданады. Ұрықтарды бластоциста кезеңінедейін культивирлейді. Кейіннен лапаротомия әдісімен бластоцистаны жұмыртқа жолынан алып, агарды алып тастап, ұрықты бағалайды.

7. Биологиялық толық ұрықтарды ұрғашы-реципиенттің ипсилатералдық мүйізшесіне еңгізеді.

Энуклеация әдісі. Әдіс келесі процедуралардан тұрады:

1. Овуляциядан өткен жұмыртқа жасұшаны донордың репродуктивтық жолынан алып дайындау.

2. Микроинемен ұрықтандырылмаған жұмыртқа жасұшаны полярлы дененің астында кесіп цитохалазин қосылған фосфаттық ортаға салады.

3. Пипеткамен полярлы денені және оның қасындағы цитоплазманы бір сағат культивирлеуден кейін сорып алады. Сонымен жұмыртқа жасұшасы екіге бөлінеді. Полярлы дененің бар жартысында метафаза ІІ кезеңіндегі хромосома бар (жұмыртқа жасұшаның «ядролық» жартысы). Екінші бөлекте ядролық құрылымдар жоқ («энуклеардық» жарты).

4. Жануарлардың сома жасұшаларынан бөліп алған ядроларды «энуклеардық» жұмыртқа жасұшасына салады.

5. Электроқосылудан кейін ұрықтың цитоплазмасымен ядроны фосфаттық буферге салады.

6. Ұрықтарды агарға салу (әдістемесі жоғарыда көрсетілген).

7. In vivo культивирлеу. Реципиенттің жұмыртқа жолдарына ұрықтар отырғызылып 4-6 күн инкубацияға жатады.

8. Ұрықтарды алып биологиялық толықтығын анықтау.

9. «Құрастырылған» ұрықты ақырғы реципиентке отырту.

Химералық жануарлар

Химера – бір неше эмбриондардың бластомераларының қосылу үдірістерінен шыққан жануарлар. Химералар екі немесе одан да көп ұрықтануға дайын тұрған эмбриондардың бластомераларының қосылуымен алынады. Жұмыстар өткізгенде генетикалық жыныс анықталмайды, сондықтан жыныс хромосомаларына сәйкес мозаикалар жаратылады (ХХ+ХХ, ХХ+ХУ). Генетикалық мозаикалардың ішінде фенотиптік еркектер көп болады. Гонадалардың дамуы басталған кезде ХУ-хромосомалардың 30 пайыз саны гонададан тестикул дамығанға жеткілікті. ХХ және ХУ хромосомды жасұшалар бір бірімен араласқан кезде химералық гонадалар тестикул бағытында дамиды. Ал химералық эмбрионар дамығанда ХХ және ХУ бластомералар бір біріне жақын болмаса, олардың қасында ана безге сәйкес гистогенез жаратылып, гермафродиттық даму басталады. Тышқандарда бір жағында ана без, бір жағында ұрық без дамыған жағдайлар бар.

Химералық жануарлар алу жолдары З. Макзарен және Н. Доурин жұмыстарында жазылған.

Химералар жасағанда екі әдіспен қолданады: 1) агрегациялық - бір ұрыққа әр түрлі генотипті екі немесе одан да көп бластомераларды қосу; 2) инъекциялық - бластоцистаның ішіне басқа ұрықтан алынған бластомераны кіргізу.

Агрегациялық әдіс. 8-12 бластомералық кезеңдегі әр түрлі генотипті ұрықтарды алады. Әдістеме келесі процедуралардан тұрады:

2. 8-12 бластомералық кезеңдегі ұрықтарды ұрғашы-донорлардың жыныс жолдарынан алу. Әр түрлі генотипті ұрықтарды алып, оларды 1 мл М16+БСА ортасынмен жуады.

3. Бас жақта көрсетілген әдіске сәйкес пеллюцид зонасын алу.

4. М16+БСА микротамшыға салып екі ұрықты біріктіреді және 37 градуста культивирлейді. Культивирлеген күні ұрықтарды пипетка көмегімен 2-3 рет агрегация өту үшін бір біріне жақындатады. Ұрықтар 24-48 сағат агрегация аяқталу үшін (бластоциста жаратылғанға дейін) инкубацияда болады.

5. Химералық ұрықтарды ұрғашы-реципиенттердің жыныс жолдарына транспланттайды.

Инъекциялық әдіс. Бластоциста кезеңіндегі ұрықтармен қолданады. Әдістеме келесі процедуралардан тұрады:

1. Ұрғашы-донорлардың жыныс жолдарынан әр түрлі бластоциста кезеңіндегі ұрықтарды алу. Әр түрлі генотипті ұрықтарды 1 мл М16+БСА ортасымен жуады.

2. Пеллюцид зонасын проназамен алу.

3. In vitro культивирлеу (37 градуста 1 сағат).

4. Ұрық-донордан бөлініп алынған бластомераларды ұрық-реципиентке инъекциялайды.

5. Химералық ұрықты 12 сағат in vitro культивирлеу.

6. Химералық ұрықты ұрғашы-реципиенттің жыныс жолына салу.

Сонымен, химералық жануарлар алғанда жасұшалардың гибридизациясы болмайды. Химералық жануарлар ұрпақтарға генетикалық мозаика қасиеттерін бермейді.

Дата добавления: 2015-08-31