М. М. Воробьева, Д. В. Галиновский, С. А. Белая, Н. В. Воронова

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНА CYP6A13

ТЛЕЙ MYZUS PERSICAE (SULZER, 1776)

Белорусский государственный университет, г. Минск,

e-mail: [email protected]

Введение. Во всех регионах мира, в том числе в Беларуси, насекомые-фитофаги представляют серьезную угрозу для растений как возделываемых, так и свободно произрастающих. Особенно опасны в этом отношении насекомые, например, настоящие тли (Aphididae), выступающие переносчиками вирусов растений. Несмотря на то, что растения в процессе коэволюции с вредителями выработали целый ряд защитных приспособлений, их устойчивость не является абсолютной и может преодолеваться насекомыми. Некоторые виды тлей способны поражать большинство рецентных видов растений, включая токсичные, листья которых содержат алколоиды и терпены, известные инсектицидными и репеллентными свойствами. Данная способность тлей проявляется в силу особенностей биологии тлей (телескопического партеногенеза и способности к анголоциклии) и характера питания (в первую очередь, флоэмососущих тлей).

Как известно [1], за нейтрализацию фитотоксинов, попадающих в организм насекомого в процессе питания соком растений, отвечают белки суперсемейства цитохромов р450 [2]. Количество генов CYP450, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков, у насекомых может значительно варьировать: от 85 у тлей Acyrthosiphon pisum (Harris, 1776) до 114 − у Myzus persicae (Sulzer, 1776). Было показано, что у M. persicae, адаптированных к питанию на растениях табака, наблюдается вторичная амплификация генов CYP6, проходящая без видимого метаболического ущерба [3]. Как полагают, эта особенность позволяет M. persicae питаться не менее чем на 1327 видах растений, принадлежащих к 109 различным семействам и отличающихся между собой содержанием и составом вторичных метаболитов [4]. Изучение 6-го семейства суперсемейства CYP450 и их белковых продуктов представляет актуальную задачу, поскольку данные ферменты отвечают как за метаболизм фитотоксинов, так и за нейтрализацию ксенобиотиков у тлей и могут обеспечивать устойчивость к ним.

Цель настоящего исследования − клонировать ген, ассоциированный
с устойчивостью к инсектицидам у тлей M. persicae, а именно ген СУР6А13.

Материалы и методика исследований. В работе были использованы лабораторные линии тлей M. persicae с редьки черной (Raphanus sativus L., 1753), перца овощного (Сapsicum annuum L., 1753) и моркови посевной (Daucus carotasub sp. sativus (Hoffm.) Arcang, 1882).

Для выделения РНК использовали коммерческий набор «GeneJET RNA Purification Kit» (Thermo Scientific). Концентрацию препаратов РНК оценивали спектрофотометрически (Ultrospec 3300pp, Швеция). Синтез кДНК осуществили с использованием набора реагентов «Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit» (Thermo Scientific), используя в качестве матрицы РНК, предварительно очищенную от геномной ДНК. ПЦР провели с использованием собственных праймеров CYP6A13f7/ CYP6A13r8 [5], позволяющих амплифицировать участок белок-кодирующей области гена СУР6А13 длиной 1132 п.н.

ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл следующего состава: 200 мкМ dNTP, 1 мкМ каждого праймера, 2,5 мкМ MgCl2, 1×PCR Buffer, 1 ед. Taq-полимеразы и 0,5 мкг матрицы. ПЦР проводили в режиме: 94°С – 5 мин; 35 циклов по 94°С – 1 мин, 45°С – 1 мин, 72°С – 2 мин; 72°С – 10 мин. Электрофорез проводили в 1,5% агарозном геле. Для выделения из агарозного геля фрагмента ДНК нужной длины использовали набор «GeneJET Gel Extraction Kit» (Thermo Scientific). Концентрацию ПЦР-продуктов оценивали по интенсивности флуоресценции сравнением
с маркерными фрагментами известной концентрации.

Для клонирования использовали набор «CloneJET PCR Cloning Kit» (Thermo Scientific), включающий плазмиду pJET1.2. Плазмиду, несущую интересующую вставку, вводили в клетки E. сoli XL1-Blue по методике с использованием 0,1 М CaCl2. Высев бактерий проводили на полноценную агаризованную LB-cреду, содержавшую ампициллин в концентрации 50 ед/мл. Полученные бактерии проверяли на наличие плазмиды со вставкой нужного размера методом ПЦР (можно подробнее, если место позволяет) и последующим электрофоретическим разделением ПЦР-продуктов в 1,5% агарозном геле.
В качестве флуоресцентного красителя использовали ZUBR-Green (Праймтех, Беларусь), длину фрагментов определяли относительно маркера молекулярного веса 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).

Результаты исследований и их обсуждение. В работе выделили общую РНК из изолированных лабораторных линий тлей M. persicae, которых культивировали на разных кормовых растениях, отличающихся между собой содержанием токсичных вторичных метаболитов (перец овощной, морковь посевная и редька черная). На электрофореграмме (рисунок 1) представлены образцы РНК из перца овощного
(лунки П1−4), моркови посевной (П5−6 лунки) и редьки черной (П7−8 лунки).
В таблице представлены результаты измерения оптической плотности и концентрации РНК данных образцов.

Рисунок 1 – Электрофореграмма препаратов РНК, выделенной из тлей M. persicae

№	Кормовое растение	λ 260	λ 280	λ 320	Концентрация РНК мкг/мл
П1	Перец овощной	0,059	0,035	0,08	32,5
П2	Перец овощной	0,107	0,060	0,012	60,5
П3	Перец овощной	0,048	0,032	0,015	23,0
П4	Перец овощной	0,100	0,058	0,014	55,0
М1	Морковь посевная	1,506	0,838	0,015
М2	Морковь посевная	0,263	0,150	0,013	159,5
Р1	Редька черная	2,118	1,167	0,016
Р2	Редька черная	0,044	0,031	0,018	16,5

Образцы П3 и Р2 имели низкую концентрацию РНК, поэтому были исключены из дальнейшей работы. На основе оставшихся образцов РНК синтезировали кДНК. Для синтеза брали аликвоту, содержавшую 0,5 мкг РНК, очищенной от геномной ДНК. Далее полученную к ДНК использовли в качестве матрицы для синтез фрагмента гена

Таблица – Характеристика препаратов РНК, выделенных из тлей M. Persicae (или полноразмерного гена) СУР6А13. В результате амплификации были получены ПЦР-продукты ожидаемой длины для линии тлей, с каждой культуры. Для очистки целевых фрагментов ДНК от неспецифических продуктов амплификации, ПЦР-продукт размером около 1,1 т.п.н. экстрагировали из геля. Концентрацию фрагментов нужного размера оценили по интенсивности флуоресценции: в образцах с редьки черной
и моркови посевной она составила 10 нг/мкл, с перца овощного – 9 нг/мкл.

Перед лигированием ПЦР продукта с плазмидой провели ферментативную реакцию отщепления концевого неспецифического нуклеотида, который присоединяется ферментом Taq -полимеразой в процессе синтеза ПЦР-продукта. Фрагменты кодирующей области гена СУР6А13 из тлей, собранных с моркови, клонировали в вектор pJET1.2 (полученная плазмида обозначена pJET-6) в клетки бактерий E. сoli XL1-Blue. Для тлей с других растений клонировать фрагмент не удалось.

Для подтверждения размера вставки в составе полученной плазмиды проводили ПЦР с плазмидой pJET-6 в качестве матрицы и праймерами к полилинкеру данной плазмиды. На электрофореграмме (рисунки 2) виден фрагмент нужного размера, полученного из тлей, собранных с моркови посевной.

1, 2 − вставка размером 1132 п.н.; 3 – положительный контроль (содержит вставку контрольного фрагмента); 4 − отрицательный контроль (не содержит матрицы)

Рисунок 2. – Элекрофореграмма продуктов ПЦР клонированного фрагмента

Заключение. Ген CYP6A13 тлей M. persicae был успешно клонирован
с использованием праймеров CYP6A13f7/ CYP6A13r8 для получения целевого фрагмента длиной 1132 п. н.

Литература

1. Feyereisen, R. Insect CYP Genes and P450 Enzymes / R. Feyereisen // Insect molecular biology and biochemistry / ed. L. I. Gilbert. – Elsevier, 2012, Ch. 8.
- P. 236–295.

Дата добавления: 2017-01-14