З фенотипу до гену From phenotype to gene

З фенотипу до гену From phenotype to gene

Після цікавої мутант виявлений і охарактеризовано, ми хочемо знайти ген, в якому сталася мутант

позиційного клонування

Спочатку за допомогою генетичного картування

Потім за допомогою хромосоми ходьбі

Успішний результат генетичної екрані в ідентифікації цікавих мутантів. Після того як ці мутанти були охарактеризовані, наступний крок, як правило, для ідентифікації генів, в яких мутація відбулася. Якщо мутація був проведений хімічний мутаген або іонізуючим випромінюванням, генної ідентифікації зазвичай вимагає генетичного картування та хромосомні ходьбі. Ці методи докладно описані в главі під назвою "Основи розшифровки і встановлення послідовності".

Після цікавої мутант виявлений і охарактеризовано, ми хочемо знайти ген, в якому сталася мутант

позиційного клонування

Спочатку за допомогою генетичного картування

Потім за допомогою хромосоми ходьбі

Успішний результат генетичної екрані в ідентифікації цікавих мутантів. Після того як ці мутанти були охарактеризовані, наступний крок, як правило, для ідентифікації генів, в яких мутація відбулася. Якщо мутація був проведений хімічний мутаген або іонізуючим випромінюванням, генної ідентифікації зазвичай вимагає генетичного картування та хромосомні ходьбі. Ці методи докладно описані в главі під назвою "Основи розшифровки і встановлення послідовності".

20. Candidate-gene approach Кандидат-ген підхід

Якщо мутований ген локалізований в послідовності область хромосоми, а потім подивитися на гени, які можуть бути залучені в процес у рамках дослідження

Останній крок: підтвердження генної ідентифікації

Порятунок фенотип

Мутації в той же ген в різних алелей

Після того, як мутований ген локалізується на порівняно невеликій площі хромосоми, можна шукати те, що відомо як «генів-кандидатів». Кандидат гени генами, які були локалізовані в конкретному регіоні (як правило, через геномної послідовності), які мають гомологію генів, залучених в досліджуваний процес. Цей підхід часто використовується для ідентифікації людських генів захворювань. На слайді показано розташування мутацій тау у хом'яків, який впливає на циркадний ритм. Вона була намічена використанням сінтеніі з мишачих і людських хромосомах, а потім ген був виявлений серед безлічі можливих генів-кандидатів. Після того, як ген-кандидат визначений, воно повинно бути підтверджено, що це дійсно ген, відповідальний за мутантного фенотипу. Найбільш прямий шлях для досягнення цього завдання є введення дикого типу копії гена в організмі мутанта. Якщо фенотип врятована, тобто, він повертається до дикого типу, то ця подія, як правило, вважати достатнім доказом того, що правильний ген був знайдений. Крім того, якщо є кілька алелей з тим же мутантного фенотипу, а потім знайти різні мутації в гені ж у всіх алелей є ще одним способом підтвердження особи ген.

21. інсерційного мутагенезу

Альтернатива хромосоми ходьбі

Щоб скоротити час і зусилля, необхідні для ідентифікації мутантних генів

Вставте фрагмент ДНК, який руйнує гени

Вставки випадково в хромосомах

Зробити сукупність індивідів

Кожен зі вставкою в інше місце

Екран колекцію для фенотипів

Використання вбудованої ДНК для ідентифікації мутований ген

Хромосома ходьба є досить стомлюючим і трудомістким процесом. Щоб скоротити час і зусилля, що спричинило з виявлення мутованих генів, альтернативного підходу була розроблена. Цей метод передбачає використання відомий фрагмент ДНК, щоб викликати мутації, порушуючи генів. ДНК зазвичай вставляє випадково в хромосому. Колекції або бібліотеці фізичних осіб формується, кожна з яких вставляється ДНК в інше місце в хромосомі. Ця колекція може бути обстежені на фенотип інтерес. Після того, як мутант буде знайдений, вбудованої ДНК можна використовувати для швидкого виявлення генів, в який він вставлений.

22. інсерційного мутагенів

Мобільні елементи

Мобільні елементи стрибати з введеною ДНК

наприклад, P елементів у дрозофіли

Або почати з невеликого числа елементів неавтономних

Мобілізація шляхом введення активного елемента

наприклад, AC / DS елементів у рослинах

Single-вставки елементів

наприклад, Т-ДНК в рослинах

Після вставки, не може рухатися знову

Існують різні типи ДНК, які були використані в якості інсерційного мутагенів. Мобільні елементи є мобільні фрагменти ДНК. Один підхід полягає в тому, щоб ввести транспоніруемих елемент плазміди і дозволити їй стрибати в геномі. Це шлях транспоніруемих елемент P була використана для mutagenize геномі дрозофіли. Альтернативний підхід полягає, щоб почати з невеликої кількості мобільних елементів розподілених по всьому геному. Є деякі елементи, які втратили здатність стрибати на своїх власних. Ці елементи відомі як "неавтономних елементів.«Вони залишатися в стані спокою до активного елемента вводиться в геном, в цей час вони починають стрибати. У рослинах, AC / DS система була використана для інсерційного мутагенезу. DS елементи неавтономних і не може стрибати, якщо елемент змінного струму присутній. Одним з потенційних недоліків мобільних елементів є те, що вони можуть вистрибнути з генів. Альтернативний підхід до інсерційного мутагенезу використовує ДНК, що, коли вставлений, не буде рухатися знову. Прикладом таких одним вставки елементів Т-ДНК використовується для заводу мутагенезу. Т-ДНК знаходиться в грунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, що, природно, в змозі передавати цю ДНК в рослину. Т-ДНК можуть бути розроблені, щоб утримувати цікавить гена.

23. Інсерційного мутагенезу в Arabidopsis

Т-ДНК вставляється в хромосому рослини

Екран для мутацій, які впливають на утворення квітки

Зробити геномну бібліотеку з мутантних ДНК

Зонд з Т-ДНК

Визначити мутант покоління

У моделі заводу, Arabidopsis, інсерційного мутагенезу були використані для виявлення багатьох генів. Наприклад, колекція рослин Arabidopsis приховування Т-ДНК в різних місцях на хромосомі був створений і показаний для мутантів квіти. Мутації в гені кріптогамний результат в трансформації внутрішньої дві квіткові органам. Геномної бібліотеки була зроблена з ДНК з кріптогамний мутант виявлений в колекції рослин проведенні Т-ДНК вставок. Геномної бібліотеки зондували частина Т-ДНК. Гібридизації клони потім послідовно для встановлення особи гена, в якому Т-ДНК була вставлена​​. Порівняння послідовностей з генами знайдений в базі даних показав, що безстатевий ген кодує новий член MADS-вікно сімейства транскрипційних факторів.

24. активація тегів

Варіації на інсерційного мутагенезу

Робить надлишкової функцією мутації, а не втратою функції мутації

Потенційні визначити функції гена не виявляється через втратою функції екранах

Корисно для таких випадків:

Функціонально надлишкових генів

Гени, необхідні для життєздатності

Активація мічення є варіацією на інсерційного мутагенезу. Замість того, щоб нокаутувати функції генів, активація результати мічення в надлишкової функцією мутацій. Вставка зазвичай несе сильного конститутивного промотору або підсилювач. Надлишкової функцією мутації в результаті введення активації тегів є потенціал, щоб ідентифікувати гени, які будуть пропущені у зв'язку з втратою функції екранами, зокрема, гени, які є функціонально надлишкових (тобто іншого гена в геномі здатний замінити його функції) і гени, які необхідні для життєздатності.

25. Активація позначки в Arabidopsis

Сильні установчих вірусного промотора

CaMV 35S

додана випадково

З Т-ДНК

Коли вставки поруч з геном, відбуваються наступні результати:

активація

установчий вирази

Може призвести до некоректного фенотип

У Arabidopsis, активація помітки були здійснюватися з використанням сильних вірусних підсилювач від Вірус мозаїки цвітної капусти (CaMV) 35S. Цей підсилювач був поміщений в Т-ДНК вектора для трансформації рослин і дозволило випадковим вставити в геном. Коли підсилювач приземлився біля заводу промоутер, це викликало конститувною активації сусідніх генів. Тому що багато гени експресуються тільки в певних клітинах чи тканинах, активація у всіх тканинах може призвести до ненормальним фенотипів.

26. Активація позначки в Arabidopsis II

Приклади мутантного фенотипу знайти в активації позначки екран

В активації-теги експерименту, проведеного лабораторією Детлеф Вайгель за адресою Інституту Солка, багато різних ненормальних фенотипів спостерігалися Arabidopsis. Серед генів, які були активовані були Квітучі Locus T (FT), яка контролює час цвітіння, і гени, які контролюють ріст рослин і формі листя.

Дата добавления: 2014-01-05