Определение активности фермента

Определить количественное содержание фермента в биологических объектах очень трудно, т.к. он присутствует в тканях в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве фермента судят по скорости катализируемой им реакции в стандартных условиях (t=25ºС, рН оптимальная, при полном насыщении фермента субстратом), и выражают в условных единицах.

За единицу активности фермента (Е- рус./нем. или U- англ./исп.) принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (1 мкмоль/мин). Это стандартная международная единица выражения количества фермента и его активности введена в 1962 г. Международным биохимическим союзом.

В международной системе единиц Си (1972 г.) предложена, вместо старой безымянной единицы ферментативной активности (Е или U), новая единица ферментативной активности – катал. 1 катал – это количество фермента, обеспечивающее превращение 1 моля субстрата в 1 секунду в стандартных условиях. Т.к. реакции идут гораздо с меньшей скоростью, то активность выражают в микро-, нано- и пикокаталах. 1Е = 16,67 нкат.

Для характеристики активности ферментов на практике часто используют следующие понятия:

1. Удельная активность – это число единиц ферментативной активности в 1 мг фермента, т.е. число мкмолей субстрата, превращаемое в 1 мин 1 мг фермента. Уд. активность выражается также числом каталов на 1 кг фермента (кат/кг);

2. Молярная активность – выражается в каталах на 1 моль фермента;

3. Молекулярная активность – это число молекул субстрата, превращенное в 1 мин 1 молекулой фермента. Например, молекулярная активность каталазы = 5 мин;

4. Концентрация фермента – выражается в единицах ферментативной активности Е на 1 мл раствора.

Классификация ферментов

Современная классификация ферментов разработана в 1961 г. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза. В основу классификации положен тип катализируемой реакции, которая является специфичным для каждого фермента.

Согласно этой классификации все ферменты делят на 6 главных классов:

1. Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

2. Трансферазы – катализируют реакции межмолекулярного переноса групп атомов и радикалов;

3. гидролазы– катализируют реакции расщепления при участии воды;

4. лиазы – катализируют реакции внутримолекулярного негидролитического расщепления, с образованием двойной связи или присоединения по двойной связи;

5. изомеразы – катализируют реакции изомеризации;

6. лигазы (синтетазы) – катализируют реакции синтеза с затратой энергии.

1. Оксидоредуктазы – делятся на подклассы в зависимости от типа реакции окисления:

а). Дегидрогеназы – отнимают от субстрата 2 атома водорода в виде двух протонов и двух электронов. Делятся на аэробные и анаэробные дегидрогеназы.

- аэробные дегидрогеназы (оксидазы) передают отнятый водород на кислород с образованием воды или перекиси водорода:

H

S + 1/2O₂ S + H₂O

H

CH₂OH CH₂OH

O

O

O

ОH O₂ H₂O₂ H

		Глюкозо оксидаза

OH H OH

H OH H OH

Глюкоза глюколактон

- анаэробные дегидрогеназы (редуктазы) катализируют перенос атомарного водорода на промежуточный субстрат. В общем виде:

H H

S + S₁ S + S₁

H H

Все оксидоредуктазы – сложные ферменты. Непосредственными переносчиками водорода от субстрата являются коферменты дегидрогеназ. Большинство дегидрогеназ в качестве коферментов содержат НАД, НАДФ.

НАД НАДН₂

Лактатде-гидрогеназа

СН₃ – СН - СООН СН₃ – СН - СООН

ОН О

Молочная кислота ПВК (пировиноградная кислота)

в). оксигеназы – катализируют реакции, в ходе которых кислород включается в состав окисляемого субстрата.

Делятся на моно- и диоксигеназы:

- монооксигеназы (гидроксилазы) – включают в состав субстрата один атом молекулы кислорода, а второй восстанавливается до Н₂О. Донором Н₂ обычно является НАДФН₂.

НАДФН₂ НАДФ

S - H + O₂ S –OH + H₂O

_- диоксигеназы – присоединяют к субстрату оба атома O₂

S + O₂ SO₂

г). пероксидаза и каталаза – гемсодержащие ферменты. Катализирующие реакции с участием Н₂O₂.

Простетическая группа имеет одно и тоже строение, содержит трехвалентное железо.

Пероксидаза окисляет органические соединения в организме с помощью O₂ или разлагает ее с выделением активного кислорода:

H

S + Н₂O₂ S + 2 H₂O

H

Н₂O₂ H₂O + O

Каталаза разлагает Н₂O₂ на H₂O и молекулярный кислород:

2 Н₂O₂ 2 H₂O + O₂

д). цитохромы – система ферментов, катализирующих перенос электронов на молекулярный кислород:

O₂ + 4e 2О^2-

Цитохромы являются гемопротеинами и завершают все окислительные процессы в клетках.

2. Трансферазы

Делятся на подклассы в зависимости от характера переносимых группировок:

а). метилтрансферазы – переносят метильную группу:

R-CH₃ + R₁-H R-H + R₁- CH₃

б). аминотрансферазы (трансаминазы) – переносят аминогруппу в реакциях переаминирования с кетокислотами:

R₁ R₂ R₂

СН-NH₂ + C=O R₁ - CO-COOH + CH-NH₂

COOH COOH COOH

в). фосфотрансферазы – переносят остаток фосфорной кислоты:

OH OH

R – P=O + R₁ -H R- H + R₁ -P=O

OH OH

Если донором фосфорного остатка является АТФ, то фосфотрансферазы еще называют киназами!!!

O

O

CH₂OH CH₂O-РО₃Н₂

ОН ОН ОН ОН

Н ОН Н ОН

глюкоза глюкозо-6-фосфат

г). гликозилтрансферазы – переносят остаток моносахарида - гликозил;

д). ацилтрансферазы – переносят кислотный остаток R-C=O и др.

3. Гидролазы

Делятся на подклассы в зависимости от характера субстрата. Основными из них являются:

а). эстеразы - ускоряют гидролиз сложных эфиров спиртов с органическими и неорганическими кислотами.

Важнейшие подподклассы эстераз:

- гидролазы эфиров карбоновых кислот (представитель – липаза).

Липаза ускоряет гидролиз внешних сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов

СН₂-О-СО-R СН₂-ОH

CH –O-CO-R + 2H₂O CH – O-CO – R + 2R-COOH

СН₂-О-СО-R СН₂-ОH

- фосфатазы – гидролизуют фосфорные эфиры. Например, глюкозо-6-фосфатаза:

CH₂O- РО₃Н₂ CH₂OH

O

O

+ 2H₂O + Н₃РО₄

ОН ОН ОН ОН

ОН ОН

Глюкозо-6-фосфат глюкоза

б). гликозидазы – расщепляют гликозидные связи в молекулах углеводов. Представители: сахараза, мальтаза,амилаза и др.

CH₂OH CH₂OH CH₂OH

O

Н₂О 2

ОН ОН ОН ОН

ОН ОН ОН

Мальтоза глюкоза

в). пептидгидролаза – ускоряют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Пептидгидролазы делятся на подподклассы:

1. Протеиназы или пептидил-пептидгидролазы или эндопептидазы. Они расщепляют пептидные связи внутри белковой молекулы, разлагая ее до пептидов. К ним относятся пепсин, трипсин, химитрипсин и др. ферменты. Их важная особенность – селективный характер действия. Они гидролизуют пептидные связи, образованные только определенными аминокислотами.

2. Пептидазы или экзопептидазы, отщепляющие концевые аминокислоты. К ним относятся:

- аминопептидазы (отщепляют N-концевые аминокислоты);

- карбоксипептидазы (отцепляют С - концевые аминокислоты).

г). амидазы – гидролизуют амиды кислот. Представители: уреаза, аспарагиназа и др.

NH₂-CO - NH₂ + H₂O 2 NH₃ + CO₂

Мочевина уреаза

4. Лиазы

Систематические названия ферментов этого класса образуют из названия субстрата,затем указывают отщепляемую группу и затем добавляют слово лиаза. Делятся на подклассы в зависимости от действия на связи:

а). С – С – лигазы. К ним относятся ферменты декарбоксилазы.

Например:

CН₃

СО CН₃ – С=О + CO₂

СООН пируват- Н

ПВК декарбоксилаза

б). С-О- лигазы (гидролиазы). К ним относятся гидратазы

+ Н₂О

СООН-СН=СН-СООН ОН-СН-СООН

фумаровая к-та - Н₂О СН₂ – СООН (яблочная к-та)

фумаратгидратаза

в). С-N-лиазы и др. Например, аспартат-аммиак-лиаза, катализирующая расщепление аспартата до фумарата и аммиака.

5. Изомеразы

Систематическое название ферментов этого класса образуют по схеме: субстрат-тит реакции изомеризации-изомераза. При внутримолекулярном переносе групп ферменты имеют тривиальные названия мутызы.Катализируют различные реакции изомеризации (90 ферментов). Например превращение глюкозы-6-фосфат во фруктозу –6-фосфат.

CH₂O- РО₃Н₂ CH₂O- РО₃Н₂

		O
		O

ОН

ОН ОН глюкозофосфат- ОН CH₂OН

ОН изомераза

ОН

α-глюкоза-6-фосфат β-фруктоза-6-фосфат

CH₂O- РО₃Н₂ CH₂OН

ОН ОН фосфоглюкомутаза

ОН O- РО₃Н₂

ОН ОН

Глюкоза-6-фосфат глюкоза-1-фосфат

Мутаротаза осуществляет взаимные превращения α- и β- изомеров.

6. Лигазы (синтетазы)

Систематическое название образуется по схеме: А: В лигаза (образующая АДФ), где А и В – соединяющиеся молекулы, в скобках указывается продукт расщепления нуклеозидтрифосфата, который использовался в данной реакции. Делятся на подклассы, ускоряющие реакции синтеза различных связей.

а). С-С-лигазы. Представителями лиаз, образующих С-С-связи, являются карбоксилазы, вызывающие удлинение углеродных цепей.

Например, пируваткарбоксилаза:

CН₃ СООН

СО + CO₂ + АТФ СН₂ + АДФ + Фн

СООН С= О

СООН

ПВК оксилоацетат

б). С-О-лигазы. Такой тип связи возникает при действии аминоацил-тРНК-синтетаз, активирующих аминокислоты и передающих их на т-РНК:

АТФ АМФ + ФФн

R-CH-COOH + тРНК R-CH-CO~тРНК

NH₂ NH₂

в). С-N-лиазы. Эти ферменты участвуют, например, в синтезе различных амидов. К ним относится аспарагинсинтетаза.

NH₂

СООН С=О

CH₂ NH₃ АТФ АДФ + Фн CH₂

СН-NH₂ СН-NH₂

COOH COOH

Асп. Асн.

Дата добавления: 2014-01-07