Источник рентгеновских лучей

кристалл белка

пучок рентгеновских лучей

фотоплёнка

Рис.3. Схема рентгеновского кристаллографического анализа. Однонаправленный рентгеновский поток падает на белковый кристалл, который вызывает дифракцию лучей.

Определение структуры миоглобина и гемоглобина обеспечило первые представления о природе трехмерной структуры глобулярных белков.

В отличие от рентгеноструктурной кристаллографии, ядерно-магнитная резонансная (ЯМР) спектроскопия позволяет изучать белки в растворах и, следовательно, не требует трудоемкого получения кристаллов белков. ЯМР спектроскопия основана на абсорбции электромагнитного излучения молекул в магнитных полях, позволяет определять состояние спинов определенных томных ядер. При изучении белковой структуры обычно определяют спины водородных атомов.

Рентгеноструктурная кристаллография и ЯМР спектроскопия требуют больших количеств очищенного белка.

Метод дисперсии оптического вращения (ДОВ) является также одним из важнейших методов изучения белков в их водных растворах. Он основан на способности белков вращать плоскость поляризации света, падающего на их образцы. Измерение угла вращения проводят на спектрополяриметре. Однако метод ограничен в результате гидрофобных взаимодействий и ван-дерваальсовых сил.

Для исследования белков используются также УФ-спектрофотометрия. Метод основан на гипохромном эффекте, т.е. понижении поглощения света при длине волны 190 нм белком, имеющим α-спирали и β-структуры по сравнению с белком с разрушенными этими структурами.

Используют также метод электронной микроскопии, который в совокупности с вышеуказанными методами могут дать исчерпывающую информацию о структуре белка.

При анализе аминокислотного состава пищевых белков проводят полный гидролиз исследуемого экстракта белков или пептидов и определение суммарного (аминного азота) содержания аминокислот или всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5-7 N-раствор НС1, а при анализе содержания триптофана, неустойчивого в кислой среде, раствор щелочи.

Благодаря наличию карбоксильных и аминных групп аминокислоты проявляют свои специфические реакции, которые нашли применение при разделении, идентификации и количественном определении аминокислот реакции по карбоксильным группам аминокислот протекают аналогично превращениям карбоновых кислот, т.е. образуют соли, сложные эфиры, тиоэфиры, с формальдегидом дают метильные или метиленовые производные. Сложные эфиры разных аминокислот со спиртами имеют различные коэффициенты летучести.

Поэтому их легко можно разделить фракционной перегонкой в вакууме.

В специфических реакциях аминокислот особую роль играет реакционная способность α-аминогруппы. Реакция с азотистой кислотой (реакция Ван-лайка) позволяет определить суммарное содержание аминокислот по выделившемуся газообразному азоту.

α-аминогруппа может вступать в реакцию с формальдегидом (реакция Зёренсона):

При этом аминогруппа блокируется гидроксиметиленовой группой и теряет свои основные свойства, сохраняя кислотные свойства аминокислоты, которую затем можно оттитровать раствором щелочи. Эта реакция нашла применение при количественном определении по методу формольного титрования аминокислот:

Для идентификации и количественного анализа аминокислот широкое применение получила цветная реакция с нингидрином:

При рН 5,5 и нагревании с избытком нингидрина аминокислота дегидрируется, декарбоксилируется с образованием СО₂, NНз, альдегида, а шнгидрин превращается в восстановленный нингидрин. Нингидрин, восстановленный нингидрин и аммиак затем конденсируются с образованием окрашенного соединения. Интенсивность окраски определяется фотоколориметрическим методом анализа, в основе которого лежит способ построения градуировочного графика.

Аминокислоты в белковых гидролизатах предварительно разделяют бумажной, ионообменной хроматографией или электрофорезом. Известен большной ряд реакций, лежащих в основе методов определения аминокислот: шуретовая, ксантопротеиновая, нитропруссидная, реакции Паули, Адамкевича и Вуазене, Сакагучи и др.

В таблице 5 по результатам анализа приведена расшифровка аминокислот белков муки.

Большое внимание уделяется определению общего содержания белка в пищевых объектах. Обычно определение проводят с использованием методе Къельдаля. Он основан на мокром сжигании материала в серной кислоте с использованием катализаторов: Nа₂SO₄, СuSО₄, Sе, Н₂О₂. В результате выделяющийся аммиак вступает в реакцию с серной кислотой:

2NН₃ + Н₂SО₄ = (NН₄)₂SО₄

Затем проводят отгонку NНз:

(NН₄)₂SО₄+ 2NаОН = 2NН₃ + Nа₂SO₄ + 2Н₂О

Аммиак поглощают избытком 0,1 н раствора Н₂SО₄ и титруют избыток Н₂SО₄, 1 н раствором NаОН в присутствии фенолфталеина:

Н₂SО₄ + NаОН = Nа₂SO₄ + Н₂О

Таблица 5 Аминокислотный состав белков муки (в г на 100 г белка)

Аминокислота	Яровая рожь	Твердая пшеница
Лизин	3,49	2,29
Гистидин	2,14	2,37
Аргинин	4,55	3,64
Аспарагиновая кислота	6,82	4,62
Треонин	3,26	2,82
Серии	4,11	4,37
Глутаминовая кислота	30,51	35,78
Пролин	15,29	13,92
Глицин	3,82	3,52
Алании	4,06	3,27
Цистин	2,65	2,66

Валин	5,22	4,77
Метионин	2,15	2,14
Изолейцин	4,21	4,51
Лейцин	6,65	7,46
Тирозин	2,16	2,67
Фенилаланин	5,16	5,48
Аммиак	3,40	3,91

Рассчитывают содержание азота в %.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержат 16% азота (100:16 = 6,25).

Для пшеницы получен коэффициент 5,7, т.к. ее белки содержат 17,5% азота. Для ржи, ячменя, овса, семян подсолнечника также 5,7; сои - 5,8; кукурузы - 6,25; молока - 6,38 и т.д.

По методу Къельдаля созданывысокопроизводительные, модифицированные, автоматические анализаторы типа «Къельфос».

Имеются и другие методы определения азота, такие как Дюма, нейтронно-активационный, с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Метод Дюма включается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N₂). В нейтронно-активационном методе атомы азота анализируемого образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа ¹³N. Содержание белка рассчитывается по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется фотоколориметрическим способом. Измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся в процессе минерализации образца с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Широкое распространение получил метод-инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в специальных приборах-анализаторах.

Известен нефелонометрический метод определения белка, основанный на различной степени помутнения.

Рефрактометрические методы основаны на способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света.

Дата добавления: 2014-11-25