Методы генной инженерии 3 страница

Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека. ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом большая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки. Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет. Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1-2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон, директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду». Последующие эксперименты подтвердили способность ДНК-вакцин формировать иммунитет в отношении разнообразных возбудителей. ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами.

Осознание перспективности применения генных вакцин способствовало значительному увеличению финансирования исследований в этом направлении не только со стороны государственных организаций, но и частных компаний. Характерным примером может служить небольшая американская биотехнологическая фирма «Vical Inc.», которая одной из первых приступила к разработке ДНК-вакцин. Побудительным фактом для работы в этом направлении послужили результаты одного эксперимента, проведенного в лаборатории «Vical Inc.» в 1989г., когда исследователи случайно установили, что введение «голой» вирусной ДНК мышам приводит к продукции большого количества вирусных белков. После этого фирма запатентовала метод прямого введения «голой» ДНК в клетки. Уже в 1991г. «Vical Inc.» приступила к разработке ДНК-вакцин для предупреждения инфекционных заболеваний. Через 2 года в журнале «Science» были опубликованы результаты этих исследований, подтверждающие эффективность применения ДНК-вакцины против гриппа у мышей. Вскоре компания «Vical Inc.» начала разработки производства и продажи терапевтических и профилактических ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИДа, туберкулеза, гепатита В, гепатита С, герпеса и заболеваний, вызываемых вирусами папилломы человека. Другой крупнейший производитель вакцин — компания «Aventis Pasteur» — разрабатывает ДНК-вакцины, предупреждающие инфицирование цитомегаловирусом, возбудителем малярии, Н. pylori, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом ветряной оспы и др.

Компания «Vical Inc.» проводит также клинические исследования (I или II фаза) терапевтических вакцин и методов генной терапии (на основе технологии «голой» ДНК) для лечения больных с некоторыми злокачественными новообразованиями. ДНК-вакцины обладают большим потенциалом и могут вызвать революцию в вакцинологии. Однако многие специалисты не спешат делать окончательные выводы до тех пор, пока не получат достаточное количество данных клинических исследований, убедительно свидетельствующих об эффективности и безопасности ДНК-вакцин. В ближайшие несколько лет не следует ожидать их внедрения в медицинскую практику, поскольку большинство из разрабатываемых вакцин находится на этапе доклинических или проходят I—II фазу клинических исследований.

Генотерапия в онкологии. Одновременно с развитием исследований в об­ласти генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски методов тера­певтического использования смысловых последо­вательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний и, главным образом, злокачественных опухолей и вирусных инфекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей ге­нокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических ис­пытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных болезней.

Основные методологичес­кие подходы к генотерапии различных опухолей, вполне приложимы и для борь­бы с наиболее серьезными инфекционными заболе­ваниями, например с ВИЧ-инфекцией (СПИДом).

Результаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнаде­живающими, в особенности при лечении нейродегенеративных и онкологических заболеваний нерв­ной системы.

Генная терапия злокачественных новообразований уже начата, хотя на её пути много трудностей, обусловленных необходимостью обеспечения селективности, специфичности, чувствительности и безопасности переноса генов. В настоящее время применяется следующая стратегия генной терапии рака.

· Повышение иммуногенности опухоли путём вставки цитокиновых ге­нов, а также генов, кодирующих главный комплекс гистосовместимости, лимфоцитарных лигандов.

· Направленная доставка (векторирование) генов цитокинов в клетки, которые в пределах опухоли локально могут реализовать токсические эффекты (например, в лимфоциты, инфильтрующие опухоли).

· Использование опухолеспецифических пролекарственных активаторов, т.е. вставка ферментативно пролекарственно- активирующих генов, сливающихся с промоторными системами, которые реализуются через дифференциально кон­тролируемую (идеально опухолеспецифическую) транскрипцию.

· Введение маркирующих генов, которые могут обеспечивать выявление минимально ос­тавленных после операции или разрастающихся опухолей.

· Искусственная репрессия функций генов путём вставки генов, кодирующих комплементар­ную (антисмысловую) мРНК репрессируемого гена (онкогены, гены лекар­ственной резистентности).

Небольшое число попыток генной терапии злокачественных опухолей свя­зано с введением в клетки резецированной опухоли генов интерлейкина-2 или фактора некроза опухоли. Затем эти клетки вводят подкожно в область бедра. Через 3 недели удаляют регионарный лимфатический узел (соответственно месту введения смеси трансгенных опухолевых клеток). Культивируют Т-лимфоциты, выделенные из этого узла. Кроме того, размножают лимфоциты из опухоли (опухоль-инфильтрирующие). Пациенту вводят общую массу лимфоцитов, что обеспечивает иммунную реакцию на опухолевые клетки. Так лечили боль­ных злокачественной меланомой, раком почки, запущенным раком разных органов.

Как видно из приведённых выше примеров, эра генной терапии человека уже началась. Определены принципы и методические подходы к генной тера­пии, отобраны потенциальные болезни для этого лечения. Работа продолжается одновременно в разных странах и в различных направлениях. Уже очевидно, что генная терапия будет применяться для лечения не только наследственных болезней, но и злокачественных опухолей и хронических вирусных инфекций.

Практические и теоретические результаты генной инженерии. В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК, гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее. Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.

Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений.

За короткий срок генная инженерия оказала огромное влияние на развитие молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться по пути познания строения и функционирования генетического аппарата.

Дата добавления: 2014-11-29