Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Лабораторная диагностика




Лабораторная диагностика ротавирусного гастроэнтерита в настоящее время не представляет трудности. Быстрое развитие клинического синдрома и краткосрочное пребывание больного в стационаре, диктуют необходимость применения экспресс-методов установления этиологии заболевания. Большинство методов лабораторной диагности­ки, рекомендуемые в настоящем руководстве позволяют выявить ротавирусы в течение первых суток. Выбор метода в каждом случае опре­деляется технической оснащенностью лаборатории, а также наличием соответствующих реагентов.

Традиционные методы обнаружения серологических сдвигов в сыворотках больных (реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации и связывания комплемента) имеют значение при ретроспективном ана­лизе заболевания. Поэтому для ранней серологической диагностики ротавирусной инфекции рекомендуется определение антител класса Ig M.

Объектом вирусологического исследования больного человека служат обычно фекалии. Наличие и распространение ротавирусов в окружаюшей среде выявляются путем исследования образцов почвы, пищевых продуктов и воды (сточные воды, вода естественных и искусст­венных водоемов, питьевая вода).

6.1. Обнаружение ротавирусов в клиническом материале и в образцах окружающей среды

6.1.1. Подготовка образцов для исследования; отбор проб.

При отборе проб для вирусологического исследования обладают некоторые общие требования, принимая меры предохранения материала от контаминации. Пробы отбирают только в стерильную посулу с плотной резиновой пробкой, укрепленной лейкопластырем. Транспор­тируют пробы в контейнерах со льдом или хладоагентом.

6.1.2. Приготовление суспензий, осветление, очистка образцов, удаление бактериальной флоры.

Подготовка образцов фекалий к исследованию на ротавирус вклю­чает приготовление 10% суспензии, гомогенизацию, центрифугирование при 3.000 об/мин, в течение 30 минут для удаления бактериаль­ной флоры. При обследовании объектов внешней среды, и пищевых продуктов проводят предварительное концентрирование исследуемого материала.

6.1.3. Концентрированно вирусных частиц в образцах воды

Концентрирование ротавирусов - важное условие повышения эффективности их обнаружения в водных объектах окружающей среды. Метод концентрирования ротавирусов с помощью адсорбционной хроматографии на пористом кремнеземе - макропористом стекле (МПС) прост и удобен, при использовании объемов воды от 0,1 до 10 л. При пропускании образца через слой МПС, вирус сорбируется на поверхности стекла. Для элюции вируса используют растворы, обла­дающие способностью вызывать десорбцию вируса. Вирус снимается со стекла небольшим объемом раствора, что приводит к концентрированию в десятки-сотни раз по сравнению с исходной пробой.

Для повышения адсорбционных свойств отечественные препараты стекла марки МПС - 1000 ВГХ обрабатывают следующим образом: готовят смесь (1:1) З% Н О и 6 М НС1. Стекло заливают приготовленной смесью из расчета 1 объем стекла на 2 объема смеси. Кипятят в вытяжном шкафу (без пробки) в течение 1 часа, соблюдая меры пре­досторожности. Отмывают до нейтрального рН дистиллированной водой. Высушивают при температуре 100°С.

Стеклянную колонку предварительно обработанную силиконовой жидкостью заполняют стеклом (2-3 см3), замоченным в дистиллированной воде. К исследуемой пробе (3 л) добавляют 1М раствор MgCl2, до конечной концентрации 0,05М. Воду пропускают через колонку со скоростью 150-500 мл/час, регулируя скорость протекания с помощью зажимов. Пропускают через колонку 10 мл элюирующего раствора: мясной экстракт З%, рН 9,0; или триптозофосфатный бульон 1%, рН 9,0; или трио НСl 0.1М, содержащий2MNaCl, рН 11,0 (растворы пере­числены в порядке снижения их элюирущих свойств). Сорбируют фракции объемом 1 мл, рН во фракциях доводят до нейтрального зна­чения.

6. 2. Обнаружение вирусных частиц с помощью электронной микроскопии (ЭМ) и иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ)

Так как в первые 2-3 дня болезни содержание частиц ротавируса в фекалиях типичных больных обычно велико, то для выявления ротавируса достаточно широко применяется метод ЭМ, с помощью ко­торого можно обнаружить ротавирусные частицы без дополнительного концентрирования фекальной суспензии.

Для приготовления препаратов каплю исследуемой 10% суспензии наносят на пластинку зубного воска или парафинированную бумагу. На каплю пленкой-подложкой вниз накладывают предметную электронномикроскопическую сетку. Спустя 1-3 мин, сетку промывают на капле дистиллированной воды и контрастирующего раствора (2% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты, доведенной до рН 6,5-6,6 с помощью I.NKOH), избыток которого через 30-40 сек. удаляют фильтровальной бумагой и сетку высушивают. Просмотр препаратов проводят в электронном микроскопе при инструментальном увеличении 30-50.000 х.

Ротавирусы достаточно легко выявляются при ЭМ исследовании фекальных суспензий по характерным размерам и морфологии вирусных частиц. Ротавирусы следует дифференцировать от различных вирусных частиц и вирусоподобных образований, частиц бактерио­фагов и бактериальных жгутиков, встречающихся в фекальном мате­риале.

Применение техники ИЭМ дает возможность в ряде случаев не только повысить процент обнаружения ротавирусов, но и доказать их этиологическую роль. Для исследования методом ИЭМ 0,1 мл разведенной 1:5 иммунной сыворотки животных смешивают с 0,4 мл 10% экстракта фекалий. Смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в течение 12 часов при 4°С, пос­ле чего центрифугируют в течение 90 мин, при 15.000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а полученный осадок ресуспендируют в нескольких каплях дистиллированной воды, контрастируют 2% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 6,5) и помещают на предметные сетки; избыток влаги удаляют фильтровальной бумагой. Изучение препаратов проводят в электронном микроскопе при инструментальном увеличении 50.ОООх, просматривая не менее пяти ячеек предметной сетки. В случае положительного результата ротавирусные частицы выявляются в препаратах в виде специфических скоплений (иммунных комплексов).

6.3. Выявление антигена ротавируса в исследуемом материале

6.3.1. Получение иммунореагентов

Гипериммунные сыворотки и специфические иммуноглобулины к ротавирусу получают путем иммунизации кроликов, морских свинок, кур.

Антиген для иммунизации получают следующим образом: 5 мл культуральной суспензии ротавируса SA -11 обрабатывают трипсином, вносят в матрацные колбы емкостью 1,5 литра с монослоем гетероплоидных клеток почки зеленой обезьяны 4647, инкубируют в течение 60 минут при 37°С; добавляют бессывороточную поддерживающую среду и выдерживают в течение 24-48 часов при 370С. Всю биомассу подвергают 3-х кратному замораживанию или обработ­ке ультразвуком, добавляют ПЭГ М 6000 до 8-10% концентрации, оставляют 20 часов при 40С, затем центрифугируют при 10.000 об /мин. 2 часа. Осадок ресуспендируют в ФСБ (1/30 - 1/50 от объ­ема биомассы). После очистки фреоном 113, водную фазу исполь­зуют для иммунизации животных и в качестве антигена при иммунологических исследованиях. Концентрат в объёме 1 мл содержит не менее 1010 вирусных частиц.

Иммунизация кроликов: кроликам вводят внутривенно по 2 мл препарата ротавируса в 1, 7, 35, 42 дни, забор крови на 49 день после начала иммунизации. В 1 и 35 дни вводят антиген дополнительно с полным адъювантом Фрейнда в несколько точек спины.

Фракцию иммуноглобулинов осаждают из гипериммунной сыворотки кролика 10% водным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молеку­лярной массой 6.000. Осадок собирают центрифугированием, растворяют и диализуют против 0,01М Калий-фосфатного буфера (рН-7,4) с 0,01М Nace (ФСБ). Концентрацию иммуноглобулинов определяют спектрофотометрически.

Иммунизация морских свинок: животным вводят внутримышечно 0,5 мл концентрированного препарата ротавируса с равным объе­мом полного адъюванта Фрейнда в 1,14 и 28-ой день, забор крови через две недели после последней иммунизации.

Иммунизация кур: 20-недельных кур несушек гибридов породы белый легион "Заря-17" иммунизируют внутривенно в 1, 14. 28 дни. При первой иммунизации антиген вводят дополнительно внутримышечно в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда, Максимальное количество антител в желтке наблюдают после третьей иммунизации, Куры могут быть использованы перманентно после реиммунизации.

Выделение иммуноглобулинов кур: желток отделяют от белка в скорлупе или воронке Бюхнера и отмывают водопроводной водой, Брюхнера (10 мл) переносят в центрифужную пробирку, добавляют двойной объем (20 мл) ФСБ и тщательно перемешивают. Вносят ПЭГ 6000 до концентрации 3,5% (вес/объем) и перемешивают 10 мин, при 14,ОООg. Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр в мерный цилиндр. Вносят дополнительно ПЭГ 6000 до конечной концентрации 12% и перемешивают. Выпавшие в осадок иммуноглобулины собирают центрифугированием (10 мин, 14.000). Осадок растворяют в 5 мл ФСБ (1/2 объема желтка). Концентра­ция белка в препарате обычно составляет 6-12 мг/мл.

6.3,2. Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на применении антител, меченных молекулой фермента (пероксидазой), яв­ляется одним из наиболее распространенных, эффективных и специфических методов детекции вирусного антигена. Обычно используют прямой и непрямой "сэндвич" - варианты. Фермент-маркер выявляют в цветной реакции с субстратом. Прямой вариант ИФА быстрее, чем непрямой, однако он менее чувствителен и специфичен. При постановке непрямого варианта используют антивидовой коммерческий конъюгат иммуноглобулинов с ферментом; для предотвращения неспецифического взаимодействия между конъюгатом и сорбированными на панели антителами необходимо иметь анти­вирусные сыворотки двух различных видов животных.

Непрямой вариант ИФА: в лунки вносят по 0,1 мл. антиротавирусные иммуноглобулины из желтка яиц иммунизированных кур в поло­вину (48) лунок. В другую половину вносят в качестве отрицательного контроля иммуноглобулины из яиц, снесенных до иммунизации.

Сорбцию иммуноглобулинов проводят из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при 40С. Содержимое лунок сли­вают, лунки промывают ФСБ-Т и вносят по 0,1 мл исследуемого образца в ФСБ-Т с 1% БСА и 0.01М ЭДТА в лунки с антиротавирусными и нормальными иммуноглобулинами и инкубируют 1 час при 370С.

После отмывания, в лунки вносят по 0,1 мл антиротавирусной сыворотки кролика разведенной до 1:10,00-1:25,000 в буфере ФСБ-Т, Оптимальное разведение сыворотки определяют в предвари­тельно поставленных опытах. Панели закрывают и инкубируют 2 часа при 370С. Лунки промывают и вносят по 0,1 мл коммерческого препарата меченных пероксидазой антител против IgG кроли­ка в концентрации 1-2,5 мкг/мл по содержанию пероксидазы в ФСББ-Т-БСА и инкубируют 1 час при 370С. Лунки промывают, вно­сят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (0-фенилендиамин 0.5мг/мл в 0,05М Na-цитратном буфере рН 5,0; Н2О2 - 0.030/оо. (Внимание! Работа требует осторожности!) и инку­бируют при комнатной температуре в темноте в течение 30-40мин.

Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,05 мл ЗМ Н2SO4. Результаты реакции учитывают визуально или спектрофотометрически. Положительными считают пробы, оптическая плотность которых не менее, чем в 2 раза превышает оптическую плотность отрицательного контроля.

6.3.3. Метод коагглютинации

Этот метод основан на способности белка А золотистого стафилококка штамма Cowan соединяться с Fc - фрагментом IgG, и при образована специфического комплекса антиген-антитело вызывать феномен агглютинации.

Для постановки реакции коагглютинации используют коммерческий сухой стафилококковый реагент, содержащий белок А (НИИЭМ им.Пастера, г.Санкт-Петербург), который регидратируют перед использованием в 0,1% растворе метиленового синего.

Предварительно, каждую серию гипериммунной сыворотки проверяют на наличие антистафилококковых антител. Для этого на предметном стекле смешивают равные объемы сыворотки в разведении 1:500 и 10% суспензию стафилококка. Учитывают результаты в течении 5 минут по образованию агглютината. Для работы отбирают сыворотки которые не содержат антистафилококковых антител в разведении 1:500. Для приготовления диагностикума 0,01 мл антиротавирусной сыворотки, разведенной 1:10 ФСБ смешивают с 0,5 мл 10% взвеси стафилококка, выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляют 9,5 мл ФСБ (диагностикум). Таким же образом сенсибилизируют стафилококк преиммунной сыво­роткой (контрольный реагент). Диагностикум и контрольный ре­агент используют в реакции РКА и ТРКА.

Для постановлю РКА в u -образные лунки панели вносят 0.05мл. ФСБ рН-7,4; в две лунки вносят микротитратором Такаччи или дозатором 0,05 мл 10% суспензии фекалий и готовили серийные двухкратные разведения 1:2 - 1:256. В лунки первого ряда добавляют по 0,05 мл диагностикума, а в лунки второго ряда по 0,05 мл контрольного реагента. Панели накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37°С - 3 часа. В каждом опыте испытываются ранее установленные путем электронной микроскопии положительная и отрицательная на ротавирус проба суспензии фе­калий, а также лизаты клеток инфицированных ротавирусом Sa-II.

Учет реакции: положительными считают результаты, когда в ряду с диагностикумом выявляется агглютинационный "зонтик", при отрицательном результате или снижении титра в 4 раза в параллельном ряду с контрольным реагентом. Отрицательными считают результаты, когда в обоих параллельных рядах образуются диски. В целях устранения неспецифической коагглютинеции в парных рядах суспензию фекалий адсорбируют с равным объемом нормальной сы­воротки кролика при 370С в течение 2-х часов, с последующим прогреванием при 80°С в течение 45 минут. Затем повторно испы­тывают в реакции коагглютинации.

6.3.4. Метод твёрдофазной реакции коагглютинации (ТРКА)

Данный метод выявления ротавирусных антигенов базируется на принципах твёрдофазного иммуноферментного метода (см.4.3.2). Однако, в отличие от последнего, в ТРКА в качестве метки исполь­зуется не фермент, а диагностикум и контрольный реагент (см.4.3.3)

Для постановки ТРКА используют панели с u-образным дном лунок. Для сенсибилизации в лунки вносят по 0,1 мл. гипериммунной сыворотки, разведенной 0,01М карбонатно- бикарбонатным буфером (рН 9,6) 1:1000. Панели с сыворотками оставляют на 2-3 часа при 37°С. Не связавшиеся с твердой фазой антитела удаляют трёхкратным отмыванием по 3 мин. ФСБТ. После этого в лунки вносят по 0,05 мл исследуемых, а также заведомо положительных и отрицательных проб (по 2 лунки для каждой пробы) и оставляют на 2 часа при 37°С для образования ком­плексов антиген-антитело. Не связавшийся антиген и сопутствующие примеси удаляют трехкратным отмыванием ФСБТ. Затем в одну лун­ку добавляют 0,05 мл 0,5% стафилококкового диагностикума, во вторую (контрольную) 0,05 мл 0,5% взвеси стафилококка, сенсибилизированного преиммунной сывороткой (см. 4.4.3). Инкубацию проводят либо в течение 1-2 часов при 37°С с последующим поме­щением на 1-3 часа при 4°С, либо в течение 18-24 часов при 4°С. Результат реакции агглютинации учитывают визуально: при положительной реакции - агглютинированные бактерии образуют "зонтик"; при отрицательной реакции - бактерии полостью осе­дают в виде диска.

6.3.5. Метод непрямой гемагглютинации

При этом методе выявление антигена ротавируса основано на использовании антительного эритроцитарного диагностикума, представляющего собой эритроциты барана, сенсибилизированные иммуноглобулином асцитной жидкости белых крыс, иммунизированных ротавирусом SA-II.

Двукратные разведения 10% фекальной суспензии в лунках панели испытывают с эритроцитарным диагностикумом. Агглютинация эритроцитарного диагностикума свидетельствует о наличии антигена ротавируса в пробе. Подробное описание методики постановки РНГА изложено в инструкции, прилагаемой к комплекту препарата (На­учно-производственное объединение "Ростэпидкомплекс" г. Ростов -на-Дону).

Комплект "Ротатест" основан на обратной пассивной гемагглютинации и предназначен для выявления ротавируса в faeces и для определения антител против ротавируса в сыворотках кро­ви.

6.3.6. Метод иммуноцитохимической детекции ротавируса

Метод основан на иммунохимическом определении вирусного антигена синтезирующегося в клетках в результате их заражения вируссодержащим материалом.

Преимущество метода по сравнению с ИФА заключается в более высокой чувствительности.

Постановка опыта: перевиваемые клетки почки зеленой обезья­ны в концентрации 3-105 кл/мл вносят по 0,2 мл. в лунки плоско­донных панелей и инкубируют при 37° (24-48 час.). Затем клетки промывают средой Игла-МЕМ. Тестируемый материал разводят в среде Игла-МЕМ, активируют в течение 1 часа при 57°С в присутствии 10 мкг/мл трипсина, и вносят по 0,1 мл не менее, чем в 4 лунки. Положительным контролем служат лунки, в которые внесен материал, заведомо содержащий ротавирус. Отрицательные контроли: лунки с незараженными клетками и лунки, в которые внесен материал, аналогичный исследуемому, но заведомо не содержащий ротавирусов. Адсорбцию проводят в течение 1 часа при 37°С, затем среду уда­ляют, клетки промывают средой Игла-МЕМ. В лунки вносят по 0,2 мл среды Игла-МЕМ с 1 мкг/мл трипсина и инкубируют 48 часов при 37°С.

Клетки дважды промывают физиологическим раствором и фиксируют охлажденным (-20°) 85% ацетоном, выдерживают 2 часа при -20°, затем ацетон удаляют. Панель отмывают 3 раза ФСБ-Т, содержащим 0,05% Твина 20 (ФСБ-Т). В лунки вносят поО,1 мл разведенной 1:1000 в ФСБ-Т иммунной антиротавирусной сыворотки кролика. Инкубируют 2 часа при 37°С. После отмывания панели в лунки вносят по 0,1 мл препарата меченных пероксидазой антител против IgG -кролика (коммерческий препарат), в концентрации 2 мкг/мл по содержанию пероксидазы в ФСБ-Т с 1% БСА и инкубируют 1,5 часа при 37°С.

Панель отмывают 2 раза ФСБ-Т и 1 раз 0,05М ацетатным буфером, рН 5,0. В лунки вносят по 0,1 мл свежеприготовленного раствора субстрата пероксидазы, содержащего на 10 мл ацетатного буфера / 4мг 3-амино-9-этилкарбазола (АЭК), растворенного в 0,5 мл ацетона, и 0,01 мл 33% перекиси водорода (Внимание! Ра­бота с АЭК требует осторожности). Инкубируют 30-40 мин, в темно­те при комнатной температуре. Реакцию останавливают, отмывая па­нель дистиллированной водой.

Учет реакции проводят под световым микроскопом с малым увеличением. Лунки с отрицательными контролями не должны содержать окрашенных клеток. Локальные скопления окрашенных клеток представляют собой фокусы вирусной инфекции.

6.3.7. Метод иммунофлюоресценции

Для выявления антигена ротавируса методом иммунофлюоресценции используют линию клеток 4647. Клетки выращивают на покровных или предметных стеклах, вложенных в пенициллиновые флаконы или пробирки. Инфицированную культуру инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов, после чего стекла извлекают из флаконов, промывают в 0,15 М физиологическом растворе с добавлением фосфат­ного буфера при рН 7,2, споласкивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Затем препараты фиксируют в двух сме­нах (по 10 мин, в каждой) химически чистого охлажденного до 4°С ацетона.

Препараты обрабатывают по непрямому методу во влажной камере. На клетки культуры наносят по одной капле иммунной ротавирусной сыворотки кролика и выдерживают 30 мни, при 37°С, затем препараты отмывают трехкратно в ФСБ и удаляют избыток влаги. Влажные препараты окрашивают смесью равных объемов антивидового ФИТЦ-конъюгата и бычьего альбумина, меченого родамином и ин­кубируют в течение 30 мин, при 37°С. После 3-кратной промывки в ФСБ препараты высушивают на воздухе. В целях устранения неспецифической флюоресценции антивирусную сыворотку перед употребле­нием адсорбируют гомогенатом нормальной клеточной культуры, а ФИТЦ - конъюгат обрабатывают активированным углем по общеприня­тым методикам.

В качестве обязательных контролей используют: обработанные аналогичным способом препараты незараженных культур и препараты зараженных культур, обработанные на первом этапе нормаль­ной, а также гетерологичой антивирусной сывороткой той же ви­довой принадлежности, что и иммунная сыворотка к ротавирусу.

В случае положительных результатов в цитоплазме клеток наблюдают отчётливую ярко-зелёную флюоресценцию.

6.4. Метод электрофоретипирования ротавирусов

Метод основан на идентификации ротавирусов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле вирусных геномных РНК-сегментов. Мзтод позволяет дифференцировать штамы ротавирусов на основании различий в электрофоретической подвижности индивидуальных РНК-сегментов различных изолятов, в связи с чем широко применяется в эпидемиологических исследованиях. Метод не требует предварительного культивирования изолятов, обладает высокой чувствительностью и абсолютной специфичнос­тью.

Метод представляет особый интерес для врачей-эпидемиологов при расследовании групповых вспышек ротавирусной инфекция.

Может быть осуществлён на базе лабораторий, оснащённых аппаратами для электрофореза.

Для проведения анализа достаточно 0,2-0,5 мл 10-20% сус­пензии фекалий. Суспензии обрабатывают фреоном 113 и инкубируют с проназой (0,2 мг/мл, 15 мин.) в присутствия додецилсульфата натрия (1%) и этилендиаминтетраацетата натрия (0.001М). После добавления ацетата натрия (О,3М) РНК депротеинизируют смесью фенол: хлороформ-изоамиловый спирт осаждают 2,5 объе­мами этанола (18 ч. при -20°С или 2 ч при -70°С). Осадок собирают центрифугированием, растворяют в воде и добавляют диссоциирующий буфер. Электрофорез проводят по методу Лэммли в пластинах 10% геля. Для окрашивания РНК в геле обычно используют нитрат серебра (0,О11М). После процедуры проявления в геле видны 11 полос РНК, соответствующих геномным сегментом ротавируса.

6.5. Определение иммуноглобулина класса М в сыворотке больного при ротавирусной ин­фекции, методом твёрдофазной реакции коагглютинации (ТРКА)

При этом используется принцип твёрдофазной реакции коагглютинации (см. 4.3.4) в модификации: для сенсибилизации лу­нок панели используют 0,1 мл коммерческой бараньей моноспецифической сыворотки против Ig M человека, в разведении 1:1000. Панели инкубируют 2-4 часа при370С. Затем лунки промывают ФСБТ, заполняют 3% раствором желатина и оставляют на 30 минут при 37°С. Лунки отмывают ФСБТ и вносят по 0,05 мл исследуемых, а также заведомо положительных и отрицатель­ных сывороток, разведенных 1:100 ФСБТ (по 2 лунки для каждой сыворотки). При определении титра антител исследуют двукратные разведения тестируемых образцов (1:10 - 1:1280). Панели инкубируют 2 часа при 37°С и после отмывания в парные лунки вносят по 0,05 мл диагностикума и контрольного реагента. Ре­акцию учитывают через 1-2 часа (см, выше 4.3.4).

Этот же принцип, модифицированный ТРКА, используют для тестирования IgA и IgG антител при ротавирусной инфекции, а также при анализе молозива и молока на лактоглобулины.

Используется метод определения иммуноглобулина класса М в сыворотке больного как для ранней диагностики манифестных форм, так и дифференциальной диагностики их с бессимптомными формами рставирусной инфекции.

 




Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-12-16; Просмотров: 402; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.032 сек.