Мембранах сравнительно с критическими порами, рассчитанными

по уравнениям (2.11) и (2.15)

г* — критический радиус поры в жидкокристаллическом состоянии мемб­ранных липидов (жкс), гель-состоянии (гель), при электрическом пробое (эп), при сочетании гель-состояния с электрическим пробоем (гель+эп).

пор для липидного бислоя в жидкокристаллическом состоянии (9нм) значительно превышают размеры реальных пор, указан­ные в левом столбце. Таким образом, мембраны в различных стрессовых состояниях обладают значительным запасом проч­ности. Во-вторых, действие электрического пробоя и замора­живания бислоя, как видно в последней строке, аддитивно. Та­кой результат можно ожидать, следовательно, и при других сочетаниях физических и химических воздействий. Стрессовое воздействие таким образом, независимо от его физико-хими­ческой природы, может быть количественно оценено и его ре­зультат предсказан в рамках рассматриваемой модели. Третий вывод касается частного случая гемолиза эритроцитов. Ранее было показано что критический радиус поры в липидном бислое при температурном фазовом переходе (см. рис. 2.17) дости­гает 2 нм, что совпадает с радиусом пор эритроцита при осмо­тическом гемолизе. Этот результат может объяснить известный в криобиологии факт гемолиза эритроцитов при оттаивании замороженных клеток в изотонических условиях. Из первой строчки табл. 2.2, кроме того, следует, что простое заморажи­вание мембранных липидов может привести к гемолизу. По­мимо криобиологии, фазовый переход мембранных липидов играет важную роль в холодоустойчивости растений.

Модель формирования пор при фазовом переходе. Независи­мая оценка размера пор может быть получена путем исследова­ния предложенной В.Ф. Антоновым и сотрудниками модели формирования пор. При фазовом переходе из жидкокристалли­ческого состояния в гель по данным рентгеноструктурного ана­лиза, происходит изменение толщины бислоя и площади на мо­лекулу липида (см. рис. 1.10). Учитывая кооперативность фазо­вого перехода, можно предположить, что молекулы в доменах, перешедших в гель-фазу, и остающихся в жидкокристалличес­ком состоянии, будут находиться в разных условиях. Относи­тельно равновесного состояния молекулы в домене гель-фазы будут растянуты, а в жидкокристаллическом состоянии - сжа­ты. Появится упругое напряжение, которое приведет к наруше­нию структуры бислоя.

Для количественной оценки возникающих пор будем считать, что в гель-фазу перешло N молекул одного монослоя. В резуль­тате N молекул противоположного монослоя окажутся сжаты­ми относительно своей равновесной площади Na^f, где a^f - пло­щадь на молекулу в жидкокристаллическом состоянии, и будут стремиться разорвать противоположный монослой.

Упругая энергия деформированного участка бислоя задает­ся в соответствии с формулой Юнга:

(2.16)

где, ∆а = a^f - a^s - изменение эффективной площади молекул в плоскости бислоя при фазовом переходе, Г - коэффициент уп­ругости, равный примерно 50 мН/м.

Напряжения, возникающие в мембране, могут уменьшится или исчезнуть, если появится гидрофобная пора с последующим превращением в гидрофильную пору. При образовании поры появляется энергия натяжения кромки поры. Общее изменение энергии бислоя при образовании поры радиуса r будет равно:

здесь - у - линейное натяжение кромки поры, параметр, вве­денный Дерягиным. В расчетах у принимается равной 10 нН. Рассмотрим изменение энергии мембраны от радиуса поры. Будем считать число молекул, одновременно переходящих в твердое состояние, равным размеру кооперативной единицы N. Величина кооперативной единицы может быть определена из соотношения:

где ∆Н_вг - энтальпия Вант-Гоффа, ∆Н_т - энтальпия перехода, определяемая по теплоте поглощения. Температуру фазового перехода Т_п, полуширину перехода ∆T и энтальпию ∆Н_т опре­деляли калориметрически. Значения кооперативной единицы для некоторых липидов представлены в таблице 2.3.

Таблица 2.3. Характеристики фазового перехода синтетических и природных липидов

Зависимость энергии поры от радиуса представлена на рис. 2.18. Слева представлена эта зависимость при измене­нии N от 80 до 190 молекул. Изменение площади на голов­ку при фазовом переходе, равное 0,1 нм², оценено по дан­ным рентгеноструктурного анализа для лецитина. Видно, что изменение энергии, рассчитанное по уравнению 2.17, имеет минимум. Это означает, что появление поры энерге­тически выгодно. С ростом N значение радиуса в точке ми­нимума растет. Справа на рис. 2.18 приведена зависимость энергии поры от радиуса для мембран с постоянным N = 70 и меняющейся ∆а. Если ∆а меньше 0,08 нм², то кривая монотонно возрастает. Начиная со значения ∆а> 0,09 нм²на кривой появляется локальный минимум, т.е. появление поры становится выгодным. С ростом ∆а, также, как и с ро­стом N, значения радиуса поры в точке минимума возрас­тают. Таким образом, появление поры в мембране в области фазового перехода энергетически выгодно. Для исследо­ванных липидов минимум соответствует порам с радиусом 1,2 - 1,6 нм. Эти значения удовлетворительно совпадают с экспериментально определенными (см. табл. 2.2).

Рис. 2.18. Зависимость изменения энергии поры от радиуса, рассчитанная по уравнению (2.17); а - ∆а = 0,1 нм², N изменяется от 80 до 190 молекул, б - N молекул, ∆а изменяется от 0,08 до 0,16 нм²

Липидные поры и проницаемость мембран. С точки зрения проницаемости липидные поры принципиально отличаются от белковых каналов своим происхождением и исключитель­ной динамичностью. В то время как белковые каналы имеют строго определенные размеры, сохраняющиеся в течение всей жизни клетки, размеры липидных пор в процессе затекания

варьируют в широких пределах. Однако эта изменчивость имеет предел. Если радиус поры меньше критического, то пора в процессе затекания должна пройти все промежуточные ра­диусы и достигнуть минимального размера. Вопрос о возмож­ности полного затекания липидных пор остается открытым. Предполагается, что полному затягиванию поры препятству­ют мощные силы гидратации, проявляющиеся при сближении стенок гидрофильных пор.

Липидные поры в отличие от белковых ионных каналов не обладают выраженной избирательностью, что коррелирует с их сравнительно большими исходными размерами (см. табл. 2.2). Ясно, однако, что в процессе затекания липидные поры могут достигать сколь угодно малых размеров, в том числе сравни­мых с размерами белковых ионных каналов, что может приво­дить к перераспределению ионных токов в мембране, напри­мер, при возбуждении. Известно далее, что после выключения стрессового воздействия бислойная липидная мембрана может вернуться в состояние с низкой проводимостью, что подразу­мевает достижение порами размера, недостаточного для про­хождения гидратированных ионов. Таким образом, гидрофиль­ные липидные поры универсальны в том отношении, что могут быть использованы клеткой для транспорта высокомолекуляр­ных веществ, ионов и молекул воды.

• Исследования проницаемости липидных пор развиваются в на­стоящее время в двух направлениях: в первом исследуются мак­симально большие поры, во втором, наоборот, - липидные поры минимального радиуса. В первом случае речь идет об электро-трансфекции - способе введения в живые клетки или липосомы молекул ДНК с целью переноса и внутриклеточного введения чужеродного генетического материала. Оказалось, что внешнее электрическое поле высокой напряженности способствует про­никновению гигантской молекулы ДНК внутрь мембранной ча­стицы. Как видно из табл. 2.2, максимальный размер критичес­кой поры соответствует жидкокристаллическому состоянию бислоя липидов в отсутствие внешнего электрического поля и равен 9 нм. Наложение внешнего электрического поля напря­женностью 100 кВ/м понижает критический радиус поры до 1 нм за время 0,2 с. Поскольку при этом мембраны сохраняются, то размер липидных пор в них не превышает, очевидно, этого нижнего предела. Парадокс состоит в том, что эффективный ди­аметр статистического клубка ДНК, которая должна попасть внутрь частицы, достигает 2000 нм. Поистине задача про верб­люда, проникающего сквозь игольное ушко. Поэтому очевидно, что молекула ДНК должна проникать через мембрану в виде рас­плетенной одиночной нити. Известно, что конец нити имеет ди­аметр 2 нм и таким образом только-только может войти в пору. Однако свободная диффузия нити ДНК в поре при этом вряд ли возможна. К сожалению, механизм этого явления до конца не ясен. Предполагается, в частности, что молекула ДНК способна расширить пору и таким образом проскользнуть через мембра­ну. Проникновению ДНК могут способствовать дополнительные силы электрофореза и электроосмоса с учетом суммарного отри­цательного заряда молекулы ДНК. Не исключено, что поры с фиксированными в них концами молекулы ДНК играют роль якоря, удерживающего молекулу в определенном месте у повер­хности мембраны везикулы, а сам процесс переноса является разновидностью пиноцитоза. Исследование этого интересного с точки зрения проницаемости явления продолжается.

Второе направление исследования проницаемости мембран с участием липидных пор связано с трансмембранным перено­сом молекул и ионов воды. Известное в биологии явление вы­сокой водной проницаемости клеточных мембран полностью воспроизводится на искусственных липидных бислоях, что подразумевает участие в этом процессе гидрофильных липид­ных пор. Большой интерес в этой связи представляют резуль­таты опытов Эламрани и Блума с суспензией липосом из фос-фатидной кислоты в температурной области фазового перехода липида из жидкокристаллического состояния в гель. Прони­цаемость бислоя для молекул воды измеряли в опытах с тяже­лой водой, проницаемость для ионов воды - методом рН-скач-ка. Основные результаты представлены в табл. 2.4.

Первое, что можно отметить, это огромное различие между коэффициентом проницаемости липидного бислоя для гидратированных ионов (ион натрия) и молекул (ионов) воды. Это различие достигает 9 порядков. Столь значительное различие свидетельствует в пользу предположения о том, что в процессе затекания липидные поры могут достигать размера, недоста­точного для прохождения гидратированных ионов, но доступ­ного для прохождения более мелких частиц - молекул и ионов воды. Кроме того, фазовый переход мембранных липидов в гель-состояние сопровождается скачкообразным уменьшением коэффициента проницаемости для ионов и молекул воды. От­сюда следует, что в ходе фазового перехода из множества ли­пидных пор отбираются те, радиус которых не превышает 2 нм. И наконец, обращает внимание количественное совпадение Коэффициентов проницаемости бислойной мембраны для молекул и ионов воды, а также их одинаковая динамика при фа­зовом переходе. Естественно предположить, что молекулы и ионы воды пересекают мембрану одним и тем же путем. Этот результат позволяет некоторым ученым вернуться к известной гипотезе о том, что липидный бислой насыщен дефектами типа трансмембранных цепочек молекул структурированной воды. С точки зрения молекулярной организации структура молекул воды в этом случае идентична структуре льда. Молекулы воды связаны между собой водородными связями. Предполагается, что протоны могут передвигаться по системе межмолекуляр­ных водородных связей. Можно предложить, что такие льдоподобные цепочки воды возникают в липидном бислое в момент рождения или затекания липидных пор.

В пользу возможности протонной проводимости на границе раздела водной фазы с полярной частью фосфолипидного бислоя свидетельствуют данные о латеральной протонной проводи­мости на границе липидного бислоя с водой. Вдоль монослоя из фосфатидилэтаноламина создавался градиент рН и измерялась продольная скорость переноса протона путем регистрации флю­оресценции меченого в полярной головке фосфолипида. Одно­временно производили измерения поверхностного потенциала и поверхностного давления. Показано, что протон движется вдоль монослоя липида в том случае, если этот монослой организован 'и упорядочен. Скорость переноса значительно превышала ско­рость диффузии протонов в воде. Эффект был обнаружен в моно­слоях из большинства природных фосфолипидов. Полная дегид­ратация фосфолипидов в полярной области приводила к потере протонной проводимости. Авторы предполагают, что молекулы воды на границе раздела липид-раствор образуют четыре слоя: объемный слой раствора, слой гидратной воды, молекулы воды в котором непосредственно взаимодействуют с полярными груп­пами молекульхлипида; слой молекул воды, связанный водород­ной связью с молекулами липида на уровне карбонильной груп­пы, и, наконец, трансмембранные водные мостики. В целом на поверхности липидного бислоя образуется сеть водородных свя­зей, обеспечивающих быстрый перенос протонов. Предполага­ется при этом, что протоны, передвигающиеся в системе водо­родных связей на поверхности бислоя, не смешиваются с протонами объемного слоя воды. Таким образом, возможен мем­бранный обмен протонами между протонными каналами и про­тонными насосами, минуя раствор электролита, омывающего мембрану. Кроме того, молекулы липида в кромке липидной поры способны, как показано в последнее время, участвовать в быстром флип-флоп обмене. В сочетании с латеральной мигра­цией протонов, этот механизм также способствует эффективно­му трансмембранному переносу протонов.

Таблица 2.4. Проницаемость липидного бислоя для молекул и ионов воды

* Сочетание протон / гидроксил используется потому, что применен­ный метод не позволяет разделить потоки протонов и гидроксилов. ** ТФП - температура фазового перехода жидкокристаллическое со­стояние - гель.

Основной вывод состоит в том, что стабильность липидного бислоя и клеточной мембраны, лишенной белкового каркаса, определяется липидными порами. Эти поры образуются в ме­стах дефектов жидкокристаллической структуры липидного бислоя. Липидные поры возникают в результате тепловых флуктуации поверхности бислоя, а также могут рождаться при мембранном стрессе, сопровождающем фазовый переход мембранных липидов, при электрическом пробое и осмотичес­кой лизисе. Судьба мембраны в этих случаях будет зависеть вероятностным образом от того, будет ли липидная пора пре­вышать некоторый критический размер или нет. В первом случае мембрана порвется, во втором случае ее структура со­хранится. При сохранении стабильности мембран поры зале­чиваются, пробегая при этом все промежуточные значения Радиусов. Минимальные радиусы липидных пор могут стать сравнимыми с размерами избирательных белковых каналов, Регулирующих в норме ионную проницаемость клеточных Мембран. На последних этапах затекания липидные поры могут превращаться в водные поры, доступные только для моле­кул и ионов воды.

контрольные вопросы, задачи, задания

1. Критический радиус липидной поры в мембране зависит от краевого натяжения поры, поверхностного натяжения мембраны и мембранного потенциала. Вывести формулу для критического
радиуса поры. Рассчитать критический радиус поры при отсут­ствии мембранного потенциала. Принять краевое натяжение поры 10'¹¹ Н, поверхностное натяжение липидного бислоя 0,3 мН / м.

2. Как изменится облегченная диффузия ионов калия с участием молекулы валиномицина после фазового перехода мемб­ранных липидов из жидкокристаллического состояния в гель?

3. Осмотический эффект в живых клетках сопровождается их набуханием в гипотоническом растворе и сжатием в гипертони­ческом. Будет ли наблюдаться осмотический эффект при накоплении ионов натрия по схеме антипорта? схеме симпорта?

4. Показать, что уравнение Нернста-Планка сводится к уравнению Фика для диффузий незаряженных частиц.

5. Фермент Na⁺-К⁺-АТФаза в плазматической мембране эритроцита совершил шесть циклов. Какое количество ионов натрия и калия при этом было активно транспортировано? Сколько энер­гии было при этом израсходовано, если гидролиз одного моля АТФ сопровождается освобождением 33,6 кДж? Эффективность про­цесса энергетического сопряжения считать 100 %.

6. В клеточных мембранах известны три ионных насоса: Na⁺ -K⁺- насос, протонный насос, кальциевый насос. Каким образом осуществляется при этом активный транспорт Сахаров и аминокислот?

7. Возможен ли одновременный трансмембранный перенос ионов калия и натрия по схеме симпорта? По схеме антипорта? По схеме унипорта?

типовые тесты текущего контроля

2.1. Перенос ионов происходит в направлении:

2.2. Уравнение диффузии неэлектролитов (Фика) записыва­ется:

2.3. Молекула валиномицина переносит через мембрану:

l.K⁺и Na⁺ 3. Cl^-и ОН^-

2. Ca²⁺ 4. K⁺

2.4. Перенос вещества при облегченной диффузии идет сравнению с простой диффузией:

1. в противоположную сторону

2. быстрее

3. медленнее

4. с такой же скоростью

ГЛАВА 3. БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ПОТЕНЦИАЛЫ

Одна из важнейших функций биологической мембраны - ге­нерация и передача биопотенциалов. Это явление лежит в ос­нове возбудимости клеток, регуляции внутриклеточных про­цессов, работы нервной системы, регуляции мышечного сокращения, рецепции. В медицине на исследование электри­ческих полей, созданных биопотенциалами органов и тканей, основаны диагностические методы: электрокардиография, электроэнцефалография, электромиография и другие. Практи­куется и лечебное воздействие на ткани и органы внешними электрическими импульсами при электростимуляции.

В процессе жизнедеятельности в клетках и тканях могут воз­никать разности электрических потенциалов:

1) окислительно-восстановительные потенциалы - вследствие переноса электронов от одних молекул к другим;

2) мембранные - вследствие градиента концентрации ионов и переноса ионов через мембрану.

Биопотенциалы, регистрируемые в организме, - это в основ­ном мембранные потенциалы.

Мембранным потенциалом называется разность потенциа­лов между внутренней (цитоплазматической) и наружной по­верхностями мембраны:

В дальнейшем во всех главах книги для упрощения написа­ния формул величину ∆φ_м будем обозначать просто как φ_м. Прогресс в исследовании биопотенциалов обусловлен:

1) разработкой микроэлектродного метода внутриклеточно­го измерения потенциалов;

2) созданием специальных усилителей биопотенциалов (УПТ);

3) выбором удачных объектов исследования крупных клетоки среди них гигантского аксона кальмара. Диаметр аксонакальмара достигает 0,5 мм, что в 100 - 1000 больше, чем диа­метр аксонов позвоночных животных, в том числе человека. Гигантские, в сравнении с позвоночными, размеры аксона - этого проворного и ловкого головоногого моллюска - имеют
большое физиологическое значение - обеспечивают быструю передачу нервного импульса по нервному волокну.

Для биофизики гигантский аксон кальмара послужил вели­колепным модельным объектом для изучения биопотенциалов (недаром выдвигались предложения поставить памятник каль­мару - животному, которому так многим обязана наука, подоб­но существующим памятникам лягушке в Париже и собаке под С. -Петербургом).

В гигантский аксон кальмара можно ввести микроэлектрод, не нанеся аксону значительных повреждений.

Стеклянный микроэлектрод представляет собой стеклянную микропипетку с оттянутым очень тонким кончиком (рис. 3.1. а).

Металлический электрод такой толщины пластичен и не мо­жет проколоть клеточную мембрану, кроме того он поляризует­ся. Для исключения поляризации электрода используются не­поляризующиеся электроды, например серебряная проволока, покрытая солью AgCl. В раствор КС1 или NaCl (желатинизированный агарагаром), заполняющий микроэлектрод (рис. 3.1. б).

Второй электрод - электрод сравнения - располагается в ра­створе у наружной поверхности клетки (рис. 3.1 в). Регистри­рующее устройство Р, содержащее усилитель постоянного тока, измеряет мембранный потенциал:

Рис. 3.1. Микроэлектродный метод измерения биопотенциалов: а - стеклянная микропипетка; б - стеклянный микроэлектрод; в - схема регистрации мембранного потенциала

φ_м=φ_вн-φ_нар

Микроэлектродный метод дал возможность измерить биопо­тенциалы не только на гигантском аксоне кальмара, но и на клет­ках нормальных размеров: нервных волокнах других животных, клетках скелетных мышц, клетках миокарда и других.

Мембранные потенциалы подразделяются на потенциалы покоя и потенциалы действия.

Дата добавления: 2014-12-29