Опыты с фиксацией напряжения

Для доказательства решающей роли ионных токов в генерации нервного импульса были поставлены знаменитые опыты с фиксацией мембранного по­тенциала φ_м = φ_вн- φ_нар (Ходжкин, Хаксли и др.).

Поддержание постоянного напряжения φ_м при исследовании токов через возбужденную мембрану позволяло:

1) избавиться от емкостных токов С_м dφ_M/dt;

2) исключить изменение ионных проводимостей g_Na и g_K при изменении φ_м и изучить их изменение в различные фазы разви­тия возбуждения: g, = f (t).

Постоянная разность потенциалов между внутренней и на­ружной поверхностями мембраны поддерживается при помо­щи специальной электронной схемы (рис. 3.4), ключевой эле­мент которого - операционный усилитель (ОУ). (В основном ОУ представляют собой усилители постоянного тока, охваченные глубокой отрицательной обратной связью по напряжению.)

Между входами в ОУ - разность потенциалов микроэлектрода, помещенного внутрь аксона кальмара (1), и электрода срав­нения (2), то есть мембранный потенциал φ_м = φ_вн- φ_нар. На вы­ходе операционного усилителя создается напряжение, компен­сирующее изменение трансмембранного потенциала. Это напряжение подается на серебряный проводник (3), располо­женный вдоль аксона, чтобы по всему волокну была одна и та же мембранная разность потенциалов. Электронная схема удер­живает на выходе (внутри аксона) тот же потенциал, что и на входе ОУ, таким образом удерживается постоянный мембран­ный потенциал: φ_м = const. При помощи генератора постоянно­го напряжения (4) можно "ступенькой" изменить входное на­пряжение ОУ, например, поднять его выше порогового. Элект­ронная схема будет удерживать это заданное напряжение вовремя опыта. Амперметр (5) измеряет протекающий при этом через мембрану ток (между электродом сравнения (2) и выхо­дящим электродом ОУ (3) (рис. 3.4). В опытах с фиксацией на­пряжения можно исследовать изменение мембранного тока во времени, при развитии возбуждения, задавая разные постоян­ные значения мембранного потенциала φ_м.

Рис. 3.4. Схема исследования токов через мембрану с фиксацией * мембранного потенциала (1 - микроэлектрод, 2 - электрод "^сравнения, 3 - серебряный проводник, 4 - генератор постоянного», напряжения, 5 - амперметр, ОУ - операционный усилитель)

Будем считать ток, направленный из клетки наружу в окру­жающий раствор положительным, а внутрь клетки из окружа­ющего раствора — отрицательным.

Обнаружено, что, если поднять мембранный потенциал φ_м выше порогового (рис. 3.5а), сначала течет ток внутрь клетки,, а затем из клетки наружу (рис. 3.56).

В экспериментах, проведенных Ходжкиным, Хаксли, Бейкером, Шоу, было доказано, что фаза 1 мембранного тока свя­зана с потоком ионов натрия из окружающей среды (где кон­центрация натрия больше) в клетку (где она меньше), а фаза два объясняется вытеканием ионов калия из клетки наружу.

В своих опытах Ходжкин и Хаксли изменяли ионный состав окружающего раствора. Было обнаружено, что, если снаружи уби­рали натрий, первая фаза мембранного тока (ток внутрь клетки) пропадала. Следовательно, на самом деле, первая фаза развития потенциала действия связана с увеличением проницаемости мем­браны для ионов натрия. Поток положительных частиц в клетку приводит к деполяризации мембраны - внутренняя ее поверхность заряжается положительно по отношению к наружной.

Рис. 3.5. Результаты исследований мембранного тока методом фиксации напряжения

Во второй фазе резко увеличивается проницаемость мембраны для калия и из клетки наружу выходят положительно заряжен­ные ионы калия, в то время как натриевый ток уменьшается.

Ионный механизм развития потенциала действия был окон­чательно доказан в решающем эксперименте Ходжкина, Бей-кера и Шоу, в котором аксоплазму препарированного аксона заменили на наружный раствор, а ионный состав наружного раствора сделали таким же, как у нормальной аксоплазмы. При такой замене ионных составов изменила знак разность потен­циалов на мембране. Теперь в покое внутренняя ее поверхность была заряжена положительно по отношению к наружной. А потенциал действия оказался отрицательным.

Выдвинута гипотеза, что селективное (избирательное) изме­нение ионной проницаемости возбужденной мембраны: снача­ла для Na⁺, а потом для К⁺ - объясняется тем, что в мембране имеются специальные ионные каналы (предположительно, это поры, образованные белковыми молекулами), см. § 15. Суще­ствуют отдельно натриевые и калиевые каналы, которые откры­ваются и закрываются во время прохождения через данный Участок мембраны нервного импульса. В первой фазе - откры­ваются натриевые каналы, во второй фазе - калиевые. Соот­ветственно, сначала закрываются натриевые каналы, а затем Калиевые. Открывание и закрывание ионных каналов вызыва­ется изменением мембранного потенциала.

Одно из доказательств наличия в мембране ионных каналов -существование веществ, блокирующих ионные потоки через Мембрану.

Так, содержащийся в рыбе фугу тетрод отоксин блокирует ц₀. ступление внутрь клетки натрия и, таким образом, нарушает передачу нервного импульса, что может привести к летально­му исходу. Доказано, что тетродотоксин не влияет на проница­емость клетки для калия, значит, ионы натрия и калия на са­мом деле проходят через разные каналы.

Из-за своего специфического строения молекулы тетродотоксина, по-видимому, застревают в натриевых каналах. Под­считав число застрявших в мембране молекул тетродотоксина, удалось определить количество натриевых каналов. В разных нервных волокнах позвоночных оно было разным от 3 до 75 каналов на один квадратный микрометр площади мембраны (для сравнения количество молекул фосфолипидов = 2 • 10⁶ 1/мкм²).

Был обнаружен и специфический ингибитор калиевых кана­лов - тетраэтиламмоний.

Если обработать мембрану тетродотоксином, блокирующим натриевые каналы, в опытах с фиксацией мембранного потен­циала пропадает первая фаза (рис. 3.5), а тетраэтиламмоний, прекращающий перенос через мембрану калия, вызывает ис­чезновение второй фазы.

Рис. 3.6. Изменение проводимости мембраны для ионов калия (g_K) и натрия (g_Na) во время развития потенциала действия (справа шкала проводимости g, слева - потенциалы φ_м)

г Таким образом, установлено, что формирование потенциа­ла действия вызывается ионными потоками через мембрану: сначала ионов натрия внутрь клетки, а затем - ионов калия из клетки в наружный раствор (рис. 3.5), что связано с изме­нением проводимости мембраны для ионов калия и натрия (рис. 3.6).

Дата добавления: 2014-12-29