Ионные каналы клеточных мембран

Модель возбудимой мембраны по теории Ходжкина-Хаксли предполагает регулируемый перенос ионов через мембрану. Однако непосредственный переход иона через липидный бислой весьма затруднен. Поэтому величина коэффициента распреде­ления К в формулах (2.7, а, б) очень мала, а следовательно, был бы мал и поток ионов, если бы ион переходил непосредственно через липидную фазу мембраны.

Действительно, для перехода из раствора с диэлектрической про­ницаемостью е_р= 80 в мембрану с е_м = одного моля ионов необходимо преодолеть потенциальный барьер AW, высота которого по теории Борна определяется соотношением:

ΔW=

где е - заряд электрона, г - радиус иона. Для ионов Na⁺ и К⁺ величина ΔW составляет 350 - 400 кДж / моль. Для сравнения, энергия тепловых колебаний при температуре 300 К составляет всего RT = 2,4 кДж / моль.
Вероятность перехода иона из раствора в липидную фазу

P-e^-(ΔW/RT)

Для приведенных числовых значений ΔW можно оценить вероятность

Р-е^-(-400/2.5) ≈е-¹⁶⁰,

следовательно, в этом случае коэффициент распределения К в форму­лах (2.7, а, б) очень мал. Таким образом, непосредственный перенос ионов через липидный бислой только за счет диффузии маловероя­тен.

Это и ряд других соображений дали основание считать, что в мембране должны быть некоторые специальные структуры -проводящие ионы. Такие структуры были найдены и названы ионными каналами. Подобные каналы выделены из различных объектов: плазматической мембраны клеток, постсинаптической мембраны мышечных клеток и других объектов. Извест­ны также ионные каналы, образованные антибиотиками.

Основные свойства ионных каналов:

1) селективность;

2) независимость работы отдельных каналов;

3) дискретный характер проводимости;

4) зависимость параметров каналов от мембранного потенциалa

Рассмотрим их по порядку.

1. Селективностью называют способность ионных каналов
избирательно пропускать ионы какого-либо одного типа.

Еще в первых опытах на аксоне кальмара было обнаружено, что ионы Na⁺ и К⁺ по-разному влияют на мембранный потенци­ал. Ионы К⁺ меняют потенциал покоя, а ионы Na⁺ - потенциал действия. В модели Ходжкина-Хаксли (см. § 13) это описыва­ется путем введения независимых калиевых и натриевых ион­ных каналов. Предполагалось, что первые пропускают только ионы К⁺, а вторые - только ионы Na⁺.

Измерения показали, что ионные каналы обладают абсолют­ной селективностью по отношению к катионам (катион-селек­тивные каналы) либо к анионам (анион-селективные каналы). В то же время через катион-селективные каналы способны про­ходить различные катионы различных химических элементов, но проводимость мембраны для неосновного иона, а значит, и ток через нее, будет существенно ниже, например, для Na⁺-Ka-нала калиевый ток через него будет в 20 раз меньше. Способ­ность ионного канала пропускать различные ионы называется относительной селективностью и характеризуется рядом селек­тивности - соотношением проводимостей канала для разных ионов, взятых при одной концентрации. При этом для основ­ного иона селективность принимают за 1. Например, для Na⁺-*канала этот ряд имеет вид:

Na⁺: К⁺ = 1: 0,05.

2. Независимость работы отдельных каналов. Прохождение тока через отдельный ионный канал не зависит от того, идет ли ток через другие каналы. Например, К⁺-каналы могут быть включены или выключены, но ток через Ма⁺-каналы не меня­ется. Влияние каналов друг на друга происходит опосредован­но: изменение проницаемостей каких-либо каналов (например, натриевых) меняет мембранный потенциал, а уже он влияет на проводимости прочих ионных каналов (см. § 13).

3. Дискретный характер проводимости ионных каналов. Ионные каналы представляют собой субъединичный комплекс белков, пронизывающий мембрану. В центре его существует трубка, сквозь которую могут проходить ионы. Количество ионных каналов на 1 мкм² поверхности мембраны определя­ли с помощью радиоактивномеченного блокатора натриевых каналов - тетродотоксина. Известно, что одна молекула ТТХ связывается только с одним каналом. Тогда измерение радиоактивности образца с известной площадью позволило пока­зать, что на 1 мкм² аксона кальмара находится около 500 на­триевых каналов.

Те трансмембранные токи, которые измеряют в обычных эк­спериментах, например, на аксоне кальмара длиной 1 см и ди­аметром 1 мм, то есть площадью 3 • 10⁷ мкм², обусловлены сум­марным ответом (изменением проводимости) 500 • 3 • 10⁷ ~ 10¹⁰ яонных каналов. Для такого ответа характерно плавное во вре­мени изменение проводимости (рис. 3.6). Ответ одиночного ион­ного канала меняется во времени принципиально иным обра­зом: дискретно и для На⁺-каналов (см. рис. 4.5), и для К⁺-, и для Са²⁺-каналов (см. описание ниже).

Впервые это было обнаружено в 1962 г. в исследованиях про­водимости бислойных липидных мембран (БЛМ) при добавле­нии в раствор, омывающий мембрану, микроколичеств неко­торого вещества, индуцировавшего возбуждение. На БЛМ подавали постоянное напряжение и регистрировали ток I(t). За­пись тока во времени имела вид скачков между двумя проводя­щими состояниями.

Одним из эффективных методов экспериментального исследо­вания ионных каналов стал разработанный в 80-е годы метод локальной фиксации потенциала мембраны ("Patch Clamp"), (рис. 4.4).

Рис. 4.4. Метод локальной фиксации потенциала мембраны. МЭ - микроэлектрод, ИК - ионный канал, М - мембрана клетки, а СФП - схема фиксации потенциала, I - ток одиночного канала

Суть метода заключается в том, что микроэлектрод МЭ (рис. •!•) тонким концом, имеющим диаметр 0,5 - 1 мкм, присасывается к мембране таким образом, чтобы в его внутренний диа­метр попал ионный канал. Тогда, используя схему фиксации по­тенциала (рис. 3.4), можно измерять токи, которые проходят только через одиночный канал мембраны, а не через все каналы одновременно, как это происходит при использовании стандарт­ного метода фиксации потенциала, описанного в § 12.

Результаты экспериментов, выполненных на различных ион­ных каналах, показали, что проводимость ионного канала дис­кретна и он может находиться в двух состояниях: открытом или закрытом. Переходы между состояниями происходят в случай­ные моменты времени и подчиняются статистическим законо­мерностям. Нельзя сказать, что данный ионный канал откро­ется именно в этот момент времени. Можно лишь сделать утверждение о вероятности открывания канала в определенном интервале времени.

Рассмотрим токи через одиночные Ма⁺-каналы.

На рис. 4.5 приведены результаты опытов, при которых на мембрану N раз подавали деполяризующий сдвиг фиксирован­ного потенциала ф* = -40 мВ и регистрировали ток одиночно­го канала с помощью метода локальной фиксации потенциа­ла. Результаты опытов располагали один под другим: 1-й,

2-й...... N-й опыт (рис. 4.5, б). Эти токи текут внутрь клетки,

Их средняя амплитуда =1,6 пА (1,6 • 10"¹² А).

Канал за время одного такого деполяризующего сдвига от­крывался лишь один раз на время t_u, которое будем назы­вать временем открытого состояния канала.

Среднее значение t_H для Ма⁺-канала = 0,7 мс (от 0,3 до 1,5 мс).

Одиночный канал может открыться раньше (1-й опыт) или позже (N-й опыт). Время, в течение которого вероятность от­крывания отдельного канала велика, будем называть време­нем жизни каналов: T_Na, Т_Са. Для натриевых каналов T_Na = 2 мс.

Таким образом, процесс открытия натриевых каналов - про­цесс стохастический: сдвиг ф_м выше порогового значения уве­личивает вероятность открывания каналов, то есть идет про­цесс их активации. По прошествии времени жизни каналов T_Na вероятность их открывания падает до нуля и этот процесс на­зывается инактивацией Ма⁺-тока.

Экспериментальные записи токов одиночных каналов слож­нее приведенных на рис. 4.5. Это определяется, во-первых, ма­лыми величинами регистрируемых токов по сравнению с тока­ми шумов и, во-вторых, нестабильностью работы самих каналов.

Рис. 4.5. Токи через одиночные натриевые каналы:

а) деполяризующий сдвиг трансмембранного потенциала от потен­циала ф™ = -80 мВ до фиксированного потенциала ф* = -40 мВ; время сдвига - 14 мс;

б) дискретные токи через одиночный канал при подаче последовательно N деполяризующих сдвигов потенциала;

в) сумма токов через одиночные натриевые каналы

Несмотря на то, что ток через каждый ионный канал меня­ется скачком, зависимость суммарного трансмембранного тока ^bo времени плавная (см. рис. 4.8). Этот феномен можно объяс­нить, используя методы статистической физики. Суммарный ток I через N одиночных ионных каналов:

N

п=1

где i_n— ток через п-й_канал.

Среднее значение I суммарного тока в случае одинаковых ка­налов определяется средним током i в каждом канале:

I=Ni. Относительная флуктуация тока в одиночном канале велика:

В случае N статистически независимых каналов относитель­ную флуктуацию суммарного тока следует рассматривать как флуктуацию среднего значения случайной величины, изме­ренную N раз. При этом, как известно из математической ста­тистики, возникает поправочный множитель (корень из N), а именно:

При больших N относительные флуктуации ничтожны. Для совокупности N = 10¹⁰ ионных каналов, расположенных на участке аксона кальмара, флуктуация тока составляет 10'⁵
(0,001 %) от среднего значения тока через мембрану, то есть флуктуации тока при измерениях в этом случае практически не заметны. Для маленьких клеток, в которых может быть
порядка 10³ ионных каналов, относительные флуктуации бо­лее существенны: 1/л/Ю (3%) см. (рис. 4.5,в).

Токи одиночных К⁺-каналов имеют амплитуду до 2 пА, а сред­нее время открытого состояния t_n = 5 мс. Однако за это время канал может несколько раз открыться и закрыться на корот­кое время, то есть могут происходить осцилляции тока. В от­личие от натриевых, К⁺-каналы не инактивируются, пока ф_м выше порогового значения. Отдельные каналы во время де­поляризации могут открываться по нескольку раз.

Токи одиночных Са²⁺-каналов кардиомиоцитов имеют более сложный характер по сравнению с Na⁺- и К⁺-токами аксонов. Во время последовательных скачков деполяризации в 70 % слу­чаев Са²⁺-канал открывается на время = 1 мс; затем через каж­дые 0,2 мс он закрывается и вновь открывается и пропускает ток с амплитудой импульса ~ 1 пА. Такой процесс активации Са²⁺-тока длится около 130 - 200 мс, а затем наступает инакти­вация Са²⁺-тока. В 30 % скачков деполяризаций кальциевый канал остается закрытым.

4. Зависимость параметров канала от мембранного потен­циала. Ионные каналы нервных волокон чувствительны к мембранному потенциалу, например натриевый и калиевый каналы аксона кальмара. Это проявляется в том, что после начала деполяризации мембраны соответствующие токи на­чинают изменяться с той или иной кинетикой (рис. 4.2). На языке ионных каналов этот процесс происходит следующим образом. Ион-селективный канал имеет сенсор - некоторый элемент своей конструкции, чувствительный к действию элек­трического поля (рис. 4.6). При изменении мембранного по­тенциала меняется величина действующей на него силы, в ре­зультате эта часть ионного канала перемещается и меняет вероятность открывания или закрывания ворот - своеобраз­ных заслонок, действующих по закону "все или ничего". Экс­периментально показано, что под действием деполяризации мембраны увеличивается вероятность перехода натриевого канала в проводящее состояние. Скачок напряжения на мем­бране, создаваемый при измерениях методом фиксации потен­циала (рис. 3.5 и 4.2), приводит к тому, что большое число ка­налов открывается. Через них проходит больше зарядов, а значит, в среднем, протекает больший ток. Существенно, что процесс роста проводимости канала определяется увеличени­ем вероятности перехода канала в открытое состояние, а не увеличением диаметра открытого канала. Таково современное представление о механизме прохождения тока через одиноч­ный канал.

Плавные кинетические кривые токов, регистрируемых при электрических измерениях на больших мембранах, получают­ся вследствие суммации многих скачкообразных токов, проте­кающих через отдельные каналы. Их суммирование, как по­казано выше, резко уменьшает флуктуации и дает достаточно гладкие зависимости трансмембранного тока от времени.

Ионные каналы могут быть чувствительны и к другим физи­ческим воздействиям: механическим деформациям, связыванию химических веществ и т.д. В этом случае они являются структурной основой, соответственно, механорецепторов, хеморецепторов и т.д.

Изучение ионных каналов в мембранах есть одна из важных задач современной биофизики.

Структура ионного канала. Ион-селективный канал состоит из следующих частей (рис. 4.6): погруженной в бислой белко­вой части, имеющей субъединичное строение; селективного фильтра, образованного отрицательно заряженными атомами кислорода, которые жестко расположены на определенном рас­стоянии друг от друга и пропускают ионы только определенно­го диаметра; воротной части.

Ворота ионного канала управляются мембранным потенциа­лом и могут находиться как в закрытом состоянии (штриховая линия), так и в открытом состоянии (сплошная линия). Нор­мальное положение ворот натриевого канала - закрытое. Под действием электрического поля увеличивается вероятность от­крытого состояния, ворота открываются и поток гидратированных ионов получает возможность проходить сквозь селектив­ный фильтр.

Если ион подходит по диаметру, то он сбрасывает гидратную оболочку и проскакивает на другую сторону ионного ка­нала. Если же ион слишком велик по диаметру, как, напри-м*ер, тетраэтиламмоний, он не в состоянии пролезть сквозь фильтр и не может пересечь мембрану. Если же, напротив, ион слишком мал, то у него возникают сложности в селективном фильтре, на сей раз связанные с трудностью сброса гидратной оболочки иона.

Блокаторы ионных каналов либо не могут пройти сквозь него, застревая в фильтре, либо, если это большие молекулы, как ТТХ, они стерически соответствуют какому-либо входу в ка­нал. Так как блокаторы несут положительный заряд, их заря­женная часть втягивается в канал к селективному фильтру как обычный катион, а макромолекула закупоривает его.

Таким образом, изменения электрических свойств возбуди­мых биомембран осуществляется с помощью ионных каналов. Это белковые макромолекулы, пронизывающие липидный бислой, которые могут находиться в нескольких дискретных состояниях. Свойства каналов, селективных для ионов К⁺, Na⁺ и Са²⁺, могут по-разному зависеть от мембранного потенциа­ла, что и определяет динамику потенциала действия в мемб­ране, а также отличия таких потенциалов в мембранах раз­ных клеток.

Селективный

фильтр Ворота

Наружный поверхностный

заряд

Сенсор

Рис. 4.6. Схема строения натриевого ионного канала мембраны в разрезе

Дата добавления: 2014-12-29