Обмен хромопротеинов

Проблемы синтеза и распада хромопротеинов привлекают внимание как исследо­вателей, так и практических врачей по двум основным причинам. Во-первых, вслед­ствие широкого разнообразия биологически важных функций гемоглобина, хлоро­филла и цитохромов, в молекулах которых центральную роль играет ядро порфи-рина, обладающее способностью координационно связываться с ионами металлов (см. главу 2). Во-вторых, изменения синтеза или распада порфиринов и, соответ­ственно, их комплексов с белками приводят к нарушению жизненно важных функций и к развитию болезней у человека и животных. В данном разделе будут рассмотрены современные представления о синтезе и распаде железопорфиринов, в частности гемоглобина, наиболее изученного хромопротеина.

В организме человека содержится около 4,5 — 5,0 г железа. На долю гемоглобина крови из этого количества (если принять за 100% все железо в организме) прихо­дится 60 — 70 %, на долю миоглобина — 3 — 5 %, ферритина — 20 % (от 17 до 23 %), трансферрина — около 0,18%, функционального железа тканей - до 5 %. Содержание железа в организме регулируется главным образом интенсивностью всасывания в ки­шечнике поступающего с пищей железа. Избыток его не всасывается. Потребность в железе резко возрастает при анемиях различного происхождения. Железо всасы­вается в кишечнике в виде неорганического двухвалентного иона Fe²⁺ после осво­бождения его из комплексов с белками. В клетках слизистой оболочки кишечника железо уже в трехвалентной форме Fe³⁺ соединяется с белком апоферритином с об­разованием стабильного комплекса ферритина. Дальнейший транспорт железа к местам кроветворения осуществляется в комплексе с Pi-глобулинами сыворотки крови (комп­лекс получил название трансферрина) или железо соединяется с апоферритином тка­ней, где и депонируется в виде ферритина. При некоторых заболеваниях (например, при гемохроматозе) избыток железа откладывается в клетках системы макрофагов в виде гемосидерина, метаболически инертного соединения железа с белком.

Источниками железа для синтетических целей являются пищевые продукты, а также железо, освобождающееся при постоянном распаде эритроцитов в клетках печени и селезенки (около 25 мг за сутки). Простетические группы пищевых хромо­протеинов (гемоглобина, миоглобина), включая хлорофиллпротеины, не используются для синтеза железопротеинов организма, поскольку после переваривания небелковый

компонент — гем — подвергается окислению в гематин, который, так же как и хлоро­филл, не всасывается в кишечнике. Обычно эти пигменты выделяются с калом в неиз­мененной форме или в виде продуктов распада под действием ферментов кишечных бактерий. Следовательно, синтез сложного пиррольного комплекса в организме про­текает из низкомолекулярных предшественников de novo, а не путем обращения химических реакций распада гемсодержащих соединений.

Биосинтез гемоглобина

Учитывая, что белковая часть молекулы гемоглобина (глобин) синтезируется как все белки, ниже будет подробно рассмотрен биосинтез его простетической группы, т. е. синтез тетрапиррольного соединения — гема (см. главу 2). К настоящему времени почти полностью выяснены основные пути образования порфиринов и протопорфи-ринов, являющихся непосредственными предшественниками гема и хлорофилла. Бла­годаря исследованиям Д. Шемина и др. выяснены основные пути синтеза гема. С помощью меченых предшественников было показано, что в синтезе гема в бес­клеточных экстрактах эритроцитов птиц специфическое участие принимают глицин, уксусная и янтарная кислоты. Источником всех 4 атомов азота и 8 атомов углерода тетрапиррольного кольца является глицин. Источником остальных 26 из 34 атомов углерода является янтарная кислота (сукцинат), точнее ее производное сукцинил-КоА. Последовательность химических реакций синтеза тетрапирролов в организме живот­ных можно условно разделить на стадии.

На первой стадии, протекающей в два этапа, сукцинил-КоА взаимодействует с глицином с образованием 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК):

Эту стадию катализирует специфический пиридоксальфосфатзависимый фер­мент — 5-аминолевулинатсинтаза — ключевой, аллостерический фермент синтеза тетра­пирролов. Впервые эта синтаза была обнаружена в эндоплазматической сети клеток ■ печени. Фермент индуцируется стероидами и другими факторами и ингибируется по типу обратной связи конечным продуктом биосинтеза — гемом.

На второй стадии происходит конденсация 2 молекул 5-аминолевулиновой кис­лоты с образованием первого монопиррольного соединения — порфобилиногена.(ПБГ):

Фермент, катализирующий эту ста­дию, порфобилиногенсинтаза, также яв­ляется регуляторным ферментом, инги-бируемым конечными продуктами син­теза. Предполагается, что механизм этой сложной реакции дегидратации вклю­чает образование кетиминной связи (шиффово основание) между кетогруп-пой одной молекулы 8-аминолевулино-вой кислоты и 5-аминогруппой лизина молекулы фермента.

В следующей многоступенчатой стадии, катализируемой соответствую­щими ферментами, из 4 монопирроль-ных молекул порфобилиногена синтези­руется тетрапиррольный комплекс про-топорфирин IX, являющийся непосред­ственным предшественником гема. Не­которые этапы сложного пути синтеза окончательно не установлены.

В заключительной стадии протопор-фирин IX присоединяет молекулу железа при участии гемсинтазы (феррохелатазы) и образуется гем. Последний исполь­зуется для биосинтеза всех гемсодер-жащих хромопротеинов. Источником железа для этой реакции является ферри-тин, который считается резервным ге-мопротеином, откладывающимся в клет­ках костного мозга, печени и селезенки. Имеются указания, что, помимо железа, в синтезе гема участвуют некоторые^ч кофакторы, в частности витамин В₁₂, ионы меди, хотя конкретная их роль не установлена.

Таким образом, весь путь синтеза гема может быть представлен на схеме слева, в которой даны полные и сокра­щенные обозначения промежуточных метаболитов и ферментов.

Распад гемоглобина в тканях (образование желчных пигментов)

Продолжительность жизни эритроцитов составляет 120 дней; после этого проис­ходит их разрушение и освобождение гемоглобина. Главными органами, в которых осуществляется разрушение эритроцитов и распад гемоглобина, являются печень, селезенка и костный мозг, хотя, в принципе, оба процесса могут происходить и в клетках других органов. Распад гемоглобина в печени начинается с разрыва ос-ме-тиновой связи между I и II кольцами порфиринового кольца. Этот процесс ката­лизируется НАДФ-содержащей оксидазой и приводит к образованию зеленого пиг­мента вердоглобина (холеглобина):

В приведенных структурных формулах здесь и ниже в желчных пигмен­тах: М — метильная СН₃-группа, В —(—СН = СН₂) — винильная группа и П — (—СНг — СН₂ —СООН) — остаток пропионовой кислоты.

Как видно из приведенных формул, в молекуле вердоглобина еще сохраняются атом железа и белковый компонент. Имеются экспериментальные доказательства, что в этом окислительном превращении гемоглобина принимают участие витамин С, ионы Fe²⁺ и другие кофакторы.

Дальнейший распад вердоглобина, вероятнее всего, происходит спонтанно с осво­бождением железа, белка-глобина и образованием одного из желчных пигментов — биливердина. Спонтанный распад сопровождается перераспределением двойных свя­зей и атомов водорода в пиррольных кольцах и метановых мостиках. Образовав­шийся биливердин ферментативным путем восстанавливается в печени в билирубин, являющийся основным желчным пигментом у человека и плотоядных животных:

Основным местом образования билирубина являются печень, селезенка и, по-види­мому, эритроциты (при распаде которых иногда разрывается одна из метановых связей в протопорфирине). Образовавшийся во всех этих клетках билирубин посту­пает в печень, откуда вместе с желчью изливается в желчный пузырь (см. главу 15). Билирубин, образовавшийся в клетках системы макрофагов, имеет название свобод­ного, или непрямого билирубина, поскольку из-за плохой растворимости в воде он легко адсорбируется на белках плазмы крови, и для его определения в крови необходимо предварительное осаждение белков спиртом. После этого билирубин вступает во взаимодействие с диазореактивом Эрлиха.

В крови взрослого здорового человека содержится относительно постоянное коли­чество «общего» билирубина — от 4 до 26 мкмоль/л, в среднем 15 мкмоль/л. Около 75 % этого количества приходится на долю непрямого билирубина. Повышение его концентрации в крови до 35 мкмоль/л приводит к развитию желтухи. Более высокий

уровень билирубина в крови вызывает явления тяжелого отравления. Непрямой били­рубин, поступая с током крови в печень, подвергается обезвреживанию путем связы­вания с глюкуроновой кислотой. В этом процессе принимает участие особый фер­мент УДФ-глюкуронилтрансфераза и УДФ-глюкуроновая кислота, являющаяся до­нором глюкуроновой кислоты. При этом к билирубину присоединяются два остатка глюкуроновой кислоты с образованием сравнительно индифферентного комплекса — билирубин-диглюкуронида, хорошо растворимого в воде и дающего прямую реакцию с диазореактивом. В желчи всегда присутствует прямой билирубин. В крови коли­чество и соотношение между прямым и непрямым билирубином резко меняются при поражениях печени, селезенки, костного мозга, болезнях крови и т. д., поэтому определение обеих форм билирубина в крови имеет существенное значение в клинике при дифференциальной диагностике различных форм желтухи. При желчнокаменной болезни в состав желчных камней наряду с основным их компонентом — холестери­ном — всегда обнаруживается непрямой билирубин. Из-за плохой растворимости в воде он выпадает в осадок в желчном пузыре в виде билирубината кальция, участвую­щего в формировании камней.

Дальнейшая судьба желчных пигментов, точнее билирубина, связана с их пре­вращениями в кишечнике под действием бактерий. Сначала глюкуроновая кислота отщепляется от комплекса с билирубином, и освободившийся билирубин подвер­гается восстановлению в стеркобилиноген, который и выводится с калом. В сутки человек выделяет около 300 мг стеркобилиногена. Последний легко окисляется под действием света и воздуха в стеркобилин. Механизм бактериальных превращений билирубина до стеркобилина во многих отношениях еще не расшифрован. Имеются данные, что промежуточными продуктами восстановления являются последовательно мезобилирубин и затем мезобилиноген (уробилиноген). После всасывания небольшая часть мезобилиногена поступает через воротную вену в печень, где подвергается разрушению с образованием моно- и дипиррольных соединений. Кроме того, очень небольшая часть стеркобилиногена после всасывания через систему геморроидальных вен попадает в большой круг кровообращения, минуя печень, и в таком виде выво­дится почками с мочой. Однако называть его уробилиногеном не совсем точно (см. главу 17). Суточное содержание стеркобилиногена в моче составляет около 4 мг, и, пожалуй, именно стеркобилиноген является нормальной органической составной частью мочи. Если же с мочой выделяется повышенное содержание уробилиногена (точнее мезобилиногена), то это является свидетельством недостаточности функции печени, например при печеночной или гемолитических желтухах, когда печень час­тично теряет способность извлекать этот пигмент из крови воротной вены. Однако химически уробилиноген (мезобилиноген) не является идентичным стеркобилиногену (уробилиногену) мочи. Исчезновение стеркобилиногена (уробилиногена) из мочи при наличии билирубина и биливердина является свидетельством полного прекращения поступления желчи в кишечник. Такое состояние часто наблюдается при закупорке протока желчного пузыря (желчнокаменная болезнь) или общего желчного протока (желчнокаменная болезнь, раковые поражения поджелудочной железы человека и др.).

Таким образом, количественный и качественный анализ желчных пигментов в моче может представлять большой клинический интерес.

Глава 13 БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Целое есть нечто большее, чем простая сумма его частей.

ПЛАТОН

Одной из основных задач современной биологии и ее новейших разделов — молекулярной биологии, биоорганической химии, физико-химической биологии — яв­ляется расшифровка механизмов синтеза молекулы белка, содержащей сотни, а иногда и тысячи остатков L-аминокислот. Последние располагаются не хаотично, а в строго заданной последовательности, которая обеспечивает уникальность структуры синтези­рованной белковой молекулы, обладающей уникальной функцией. Другими словами, механизм синтеза должен обладать точной кодирующей системой, которая автома­тически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Кодирующая система определяет первичную структуру, а вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются физико-хими­ческими свойствами и химическим строением аминокислот в полипептиде.

Первоначальные представления, согласно которым синтез белка могут катализи­ровать те же протеолитические ферменты, что и вызывающие его гидролиз, но путем обратимости химической реакции, не подтвердились. Оказалось, что синтетические и катаболические реакции протекают не только различными путями, но даже в раз­ных субклеточных фракциях. Не подтвердилась также гипотеза о предварительном синтезе коротких пептидов с их последующим объединением в единую полипептид­ную цепь. Более правильным оказалось предположение, что для синтеза белка тре­буются источники энергии, наличие активированных свободных аминокислот и не­скольких видов нуклеиновых кислот.

В современные представления о механизме синтеза белка большой вклад внесли советские биохимики. Так, в лаборатории А. Е. Браунштейна было впервые указано на участие АТФ в синтезе квазипептидных связей (на примерах гиппуровой кислоты, глутамина, глутатиона и ацетанилида). В. Н. Ореховичем еще в 50-е годы было показано, что перенос аминоацильных или пептидильных группировок на NH^-rpynny аминокислот может осуществляться не только с амидной или пептидной, но и со сложноэфирной связи. Как будет показано ниже, именно этот механизм лежит в основе реакции транспептидирования в 50S рибосоме в стадии элонгации синтеза белка.

Значительно позже были получены доказательства, что в синтезе белка, про­текающем в основном в цитоплазме, решающую роль играют нуклеиновые кислоты, в частности ДНК. После того как было установлено, что ДНК является носителем и хранителем наследственной информации, был поставлен вопрос о том, каким образом эта генетическая информация, записанная (зашифрованная) в химической структуре ДНК, трансформируется в фенотипические признаки и функциональные свойства живых организмов, передающиеся по наследству. В настоящее время можно дать однозначный ответ на этот вопрос: генетическая информация програм­мирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь специфичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма (рис. 13.1). В природе, как известно, существуют два типа биополимерных макромолекул, так называемые неинформативные биополимеры (они представлены повторяющимися мономерными единицами и/или разветвленными структурами, например полисахариды, поли-АДФ-рибоза, пептидогликаны, гликопротеины) и информативные биополимеры, несущие

первичную генетическую информацию (нуклеиновые кислоты) и вторичную генетиче­скую, точнее фенотипическую информацию (белки). Эти общие представления могут быть выражены следующей последовательностью событий (поток информации):

ДНК -> РНК -► Белок -»Клетка -» Организм

Значительный вклад в современные представления о месте, факторах и механизме синтеза белка внесли исследования Т. Касперсона, М. Хогланда, П. Берга, П. За-мечника, С. Очоа, М. Ниренберга, Н. Горовица, Ф. Гауровица, С. Вейсса и совет­ских биохимиков А. А. Баева, А. Н. Белозерского, А. С. Спирина и др.

Не останавливаясь на всех исторических аспектах развития этой важнейшей проблемы, следует напомнить, что еще в 40-х годах было установлено, что ДНК локализована в ядре клетки, в то время как синтез белка протекает главным образом в микросомах цитоплазмы. Первые экспериментальные доказательства о необходимости нуклеиновых кислот для синтеза белка были получены в лаборатории Т. Касперсона. Было показано также, что присутствую­щие в цитоплазме рибонуклеиновые кислоты контролируют синтез цитоплазматических белков. Таким образом, уже тогда вырисовывалась картина тесной связи между ДНК, локализованной в ядре ', и синтезом белка, протекающим в цитоплазме и регулирующимся рибонуклеиновыми кислотами, которые были открыты как в цитоплазме, так и в ядре. На основании этих чисто морфологических данных было сделано заключение, полностью подтвержденное в настоя­щее время, что биосинтез белка, хотя нецосредственно и регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра и что РНК сначала

синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Полученные значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о том, что основной функцией нуклеиновых кислот является не только хранение генетической инфор­мации, но и реализация этой информации путем программированного синтеза специфических белков.

Однако в этой последовательности ДНК -> РНК -» Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих многообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информа­ции: они включают репликацию, т..е. синтез ДНК на матрице ДНК, транскрипцию, т. е. перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК, и трансляцию — процесс, в ко­тором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответ­ствующей аминокислотной последовательности в белке. Многие тонкие механизмы транскрип­ции и трансляции окончательно не выяснены.

ТРАНСЛЯЦИЯ И ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К СИНТЕЗУ БЕЛКА В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Прямое отношение к механизмам передачи наследственной информации имеет процесс трансляции, означающий перевод «четырехбуквенного языка нуклеиновых кислот на двадцатибуквенную речь белков». Другими словами, трансляция сводится к синтезу белка в рибосомах; в этом синтезе последовательность расположения нуклео-тидов в мРНК определяет первичную структуру белка, т. е. строго упорядоченную последовательность расположения отдельных аминокислот в молекуле синтезируемого белка.

Остановимся прежде всего на анализе тех условий, которые необходимы для осуществления синтеза белка в бесклеточной системе, а затем рассмотрим современ­ные представления о механизме этого синтеза в клетке. В классических исследованиях П. Замечника и сотр. при использовании меченых аминокислот было впервые точно установлено, что местом синтеза белка являются рибосомы. При определении радио­активности белков в различных субклеточных фракциях печени, полученных методом дифференциального центрифугирования через различные промежутки времени, было показано, что радиоактивная метка в первую очередь появляется во фракции микро-сом и лишь затем в других субклеточных образованиях. После установления места включения радиоактивной метки было выяснено участие других субклеточных фракций и низкомолекулярных клеточных компонентов в синтезе белка. При инкубации фракции микросом печени крыс с ¹⁴С-лизином включение радиоактивной метки в белки рибосом наблюдалось при наличии в системе, помимо фракции микросом, еще не­которых растворимых компонентов цитоплазмы, источника энергии в форме АТФ (или АТФ-генерирующей системы), а также ГТФ.

Дальнейшие исследования были направлены на поиск других компонентов белок-синтезирующей системы.

Белоксинтезирующая система включает: набор всех 20 аминокислот, входящих в состав белковых молекул; минимум 20 разных тРНК, обладающих спе­цифичностью к определенному ферменту и аминокислоте; набор минимум 20 раз­личных ферментов — аминоацил-тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специ­фичностью к какой-либо определенной аминокислоте и одной тРНК; рибосомы (точнее полисомы: состоящие из 4—12 монорибосом с присоединенной к ним мат­ричной мРНК); АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимаю­щий специфическое участие в инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы М^⁺ в концентрации 0,005 — 0,008 М; мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме; наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разных уровнях трансляции.

Рассмотрим более подробно структуру и функцию главных компонентов белок-синтезирующей системы.

Рибосомы

Живые организмы, как известно, в зависимости от структуры клеток делятся на две группы: прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микро­организмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, со­держат ядра с мембранами, а также митохондрии (и в ряде случаев хлороиласты).

Оба типа клеток содержат рибосомы, причем рибосомы эукариот (клетки жи­вотных) примерно в 2 раза больше рибосом прокариот (бактерий). Обычно рибосомы характеризуют но скорости их седиментации в центрифужном поле, которая коли­чественно выражается константой седиментации s, выражаемой в единицах Свед-берга S (см. главу 1).

Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она не пропорциональна размеру. Число рибосом в микробной клетке примерно равно 10⁴, а эукариот — около 10⁵.

Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие только из РНК и белка, причем 80S рибосомы эукариот содержат примерно равное их коли­чество, а у 70S рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 2: 1 (рис. 13.2). РНК рибосом принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц; это можно показать при помощи электронной микроскопии или путем обработки рибосом растворами, со­держащими низкие концентрации ионов М§^⁺. При этих условиях- рибосомы диссо­циируют на субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает размер второй; так, у 70S рибосом величины S для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом — соответственно 60S и 40S (см. рис. 12.2). Укажем также, что у Е. coli большая и малая субчастицы содержат 34 и 21 белок соответственно и, кроме того, две молекулы рРНК с коэффициентами седиментации 23S и 5S в боль­шой и одну молекулу рРНК (16S) в малой субчастице. Субчастицы рибосом клеток эукариот построены более сложно: более 70 разных белков в обеих субчастицах, при этом большая субчастица содержит 28S, 5,8S и 5S рРНК, а малая содержит 18S рРНК¹.

Для выяснения гонких молекулярных механизмов синтеза белка в рибосомах необходимы сведения о структуре и функциях рибосом. В последнее время получены данные, свидетельствующие о вероятной пространственной трехмерной структуре как целых рибосом, так и их субчастиц. В частности, выяснено, что форму и размеры 30S и 40S субчастиц рибосом предопределяют не белковые молекулы этих частиц, а тре­тичная структура входящих в их состав 16S и 18S рРНК. Более того, по данным акад. А. С. Спирина, для сохранения пространственной морфологической модели всей 30S субчастицы оказалось достаточным наличие только двух белков, содержащихся в определенных топографических участках молекулы 16S рРНК.

Относительно происхождения рибосом известно, что рРНК происходит из общего предшественника всех клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре; рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибо-сомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объеди­ненные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мемб­раны обратно в цитоплазму, где ряд рибосом вместе с мРНК образуют полисомы или полирибосомы.

Аминоацил-тРНК-синтетазы

Экспериментально доказано существование в любых клетках живых организмов специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из Е. coli.

Молекулярная масса почти всех синтетаз равна 100000 Да, за исключением фенилаланил-тРНК-синтетазы (180000 Да). Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и требуют присутствия ионов Mg²"¹". Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК; это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе «узнавание» аминоацил-тРНК основано не на при-' роде аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеются по крайней мере три центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ; ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазоль-ное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg²⁺. Наиболь­шим сродством эти ферменты, как было указано, обладают по отношению к моле­кулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого фер­менты узнают подходящую РНК, пока не ясен. В то же время эти ферменты отли­чаются низкой молярной активностью (число оборотов не превышает нескольких сот каталитических актов в минуту).

Транспортные РНК

В лаборатории М. Хогланда было выяснено, что при инкубации ¹⁴С-аминокис-лоты с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Было сделано заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую молекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в

безбелковом фильтрате. Показано, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую моле­кулярную массу и сосредоточена в раст­воримой фракции, поэтому ее сначала назвали растворимой, а позже адаптор-ной или транспортной РНК (тРНК). На долю тРНК приходится около 10—15% общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой ами­нокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая РНК (для ряда аминокислот открыто более одной, в частности для серина — 5 разных тРНК, для лизина и глицина — по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической ами-ноацил-тРНК-синтетазой). Молекуляр­ная масса большинства тРНК колеблет­ся от 24000 до 29000 Да. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов. Аминокисло­ты присоединяются к свободной З'-ОН-группе концевого мононуклео-тида, представленного во всех тРНК АМФ, путем образования эфирной связи. Интересно, что почти все тРНК обла­дают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трех­мерной структурой (рис. 13.3).

Установлена первичная структура (см. главу 3) почти всех 60 открытых тРНК; знание последовательности нук­леотидов и, следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная конформация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную, форму (см. рис. 13.3).

Определение структуры тРНК позволило выявить ряд отличительных участков; так, на З'-гидроксильном конце располагается одинаковая для всех тРНК последо­вательность триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через З'-ОН-группу концевого аденилового нуклеотида, хотя получены доказательства возможности при­соединения аминокислоты и через 2'-ОН-группу. Тимидин-псевдоуридин-цитидиловая (Т\|/Ц) петля, по-видимому, обеспечивает связывание аминоацил-тРНК с поверх­ностью рибосомы. Имеется, кроме того, добавочная петля, состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Дигидроуридиловая петля, с другой стороны, оказалась необходимой как сайт (место) для узнавания специфи­ческим ферментом —аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется также антикодоновая пет­ля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противополож-

ной стороне от того конца, куда присоединяется аминокислота (см. рис. 13.3). Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему к о д о н у мРНК, причем оба они являются антипараллельными в своей комплементарности. Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид - ГМФ со свободной 5'-фосфат-ной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей специфической аминокислотой. Но поскольку между нук­леиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислоты не суще­ствует соответствия и сродства, эту функцию узнавания должна выполнять белковая молекула, которая узнает как молекулу специфической тРНК, так и специфической аминокислоты.

Матричная РНК

Выше было указано на необходимость участия предобразованной молекулы РНК для правильной расстановки аминокислот в полипептидной цепи. Было высказано предположение, что такой молекулой может служить рРНК. Это предположение как будто бы подтверждалось и опытами по заражению клеток Е. coli ДНК фага. Оказалось, что немедленно после заражения синтез нормальных клеточных ДНК прекращался и начинался интенсивный синтез фаговой ДНК. Более того, весь белок-синтезирующий аппарат клеток перестраивался на синтез только фаговых белков. Но поскольку состав синтезированных фаговых белков отличался от состава белков бактерии, было высказано предположение, что при заражении фагом, очевидно, меняется последовательность оснований в РНК. Однако и эта гипотеза не подтверди­лась. Было высказано мнение, что предобразованная РНК, необходимая для измене­ния типа синтезируемого белка, должна обладать высокой скоростью обновления своего состава, т. е. молекула такой РНК должна синтезироваться и распадаться с такой скоростью, чтобы обеспечить быструю обновляемость нуклеотидного состава. Фактически же рРНК оказалась метаболически весьма стабильной, поэтому стано­вилось очевидным, что она не может служить в качестве матрицы.

В ряде лабораторий (в частности, в лаборатории С. Бреннера) были получены данные о существовании в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК ', названной информационной РНК (иРНК); сейчас она обозначается как матрич­ная РНК (мРНК), потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой происходит синтез белка. Эта блестящая гипотеза затем экспериментально была дока­зана в лаборатории М. Ниренберга. Последний изучал влияние различных фракций РНК на способность рибосом, выделенных из Е. coli, к синтезу белка. Некоторые фракции РНК стимулировали включение ¹⁴С-аминокислот в белки. Добавление синте­тического полинуклеотида, в частности полиуридилата (поли-У), в белоксинтезирую-щую систему приводило к включению в синтезирующуюся белковую молекулу един­ственной аминокислоты — фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной си­стеме необычного полипептида полифенилаланина. Таким образом, специфический полинуклеотид, добавленный к препаратам рибосом, включавшим известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники энергии, вызывал синтез специфи­ческого полипептида.

Эти опыты открыли прямую дорогу для экспериментальной расшифровки кода, при помощи которого информация от РНК передается на синтезируемый белок. Последовательность нуклеотидов РНК реализуется в специфической последователь­ности аминокислот синтезируемой полипептидной цепи. Опыты Ниренберга свиде-

тельствуют также о том, что не рибосома и не рРНК являются матрицей, на кото­рой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют поступающие извне матричные РНК. Итак, ДНК передает информацию на РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму. Здесь РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой молекулы. Матричная гипотеза синтеза белка, как и других полимерных молекул ДНК и РНК, получила в настоящее время полное подтверждение. Ее правильность была доказана в экспериментах, которые обеспе­чивали точное воспроизведение первичной структуры полимерных молекул; причем этот синтез в отличие от беспорядочного химического синтеза отличался не только высокой скоростью и специфичностью, но и направленностью самого процесса, в строгом соответствии с программой, записанной в линейной последовательности молекулы матрицы.

Природа генетического кода

Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК, перево­дится еще в ядре в нуклеотидную последовательность мРНК. Однако вопрос о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу, долго не был выяснен. Первые указания на существование прямой линейной зависимости между структурой гена и его продуктом — белком можно найти у Ч. Яновского, который в серии изящных опытов с применением методов генетического картирования и сек-винирования показал, что порядок изменений в структуре мутантного гена триптофан-синтазы у Е. coli в точности соответствует порядку соответствующих изменений в аминокислотной последовательности молекулы белка-фермента.

Ранее было известно, что молекулы мРНК не обладают сродством к амино­кислотам, поэтому для перевода нуклеотидной последовательности мРНК на амино­кислотную последовательность белков требуется некий посредник, названный адап-тором. Молекула адаптера должна быть в свою очередь наделена способностью узнавать нуклеотидную последовательность специфической мРНК и соответствующую аминокислоту. Обладая подобной адапторной молекулой клетка может включать каждую аминокислоту в подходящее место полипептидной цепи, в строгом соот-, ветствии с нуклеотидной последовательностью мРНК. Остается, таким образом, не­зыблемым положение, что сами по себе функциональные группы аминокислот не обла­дают способностью вступать в контакт с матрицей информационной мРНК.

Было показано, что в нуклеотидной последовательности молекулы мРНК имеются кодовые слова для каждой аминокислоты —генетический код. Проблема, однако, сводится к тому, из чего состоит этот таинственный код? Вероятнее всего, он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в мо­лекуле ДНК. Вопросы о том, какие нуклеотиды ответственны за включение опреде­ленной аминокислоты в белковую молекулу и какое количество нуклеотидов опре­деляет это включение, оставались нерешенными до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только 4 аминокислоты могут кодироваться. Но код не может быть и дуплетным, т. е. комбинация двух нуклеотидов из четырехбуквенного «алфавита» не может охва­тить всех аминокислот, так как подобных комбинаций теоретически возможно только 16 (4- = 16), а в состав белка входят 20 аминокислот. Для кодирования всех амино­кислот белковой молекулы было бы достаточно взять триплетный код, когда число возможных комбинаций составит 64 (4³ = 64).

Из приведенных выше данных М. Ниренберга становится очевидным, что поли-У, т. е. РНК, гипотетически содержащая остатки только одного уридилового мононуклео-тида, способствует синтезу белка, построенного из остатков одной аминокислоты — фенилаланина. На этом основании был сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую молекулу может служить триплет, состоящий из 3 уриди-

ловых нуклеотидов — УУУ. Вскоре было показано, что синтетическая матричная поли-цитидиловая кислота (поли-Ц) кодирует образование полипролина, а матричная поли-адениловая кислота (поли-А) — полилизина; соответствующие триплеты — ЦЦЦ и ААА — действительно оказались триплетами (названными кодонами) для кодирования пролина и лизина.

М. Ниренберг, С. Очоа и X. Корана, пользуясь искусственно синтезированными мРНК, представили доказательства не только состава, но и последовательности триплетов всех кодонов, ответственных за включение каждой из 20 аминокислот белковой молекулы. Полный кодовый «словарь» представлен в табл. 13.1.

УУУ		УЦУ		УАУ		УГУ	у
	Фен				Тир		Цис ц
УУЦ		УЦЦ		УАЦ		УГЦ
УУА		УЦА	Сер	УАА		УГА	Терм ^А
УУГ	Лей	УЦГ		УАГ	Терм	УГГ	Трп ^г
ЦУУ		ЦЦУ		ЦАУ		ЦГУ	У
	Лей				Гис		■ |
ЦУЦ		ЦЦЦ		ЦАЦ		цгц	Ц
-			Про	-			Apr
ЦУА		ЦЦА		ЦАА		ЦГА
	Иле				Глн		г-
ЦУГ		ццг		ЦАГ		ЦГГ	г
АУУ		АЦУ		ААУ		АГУ	у
АУЦ	Иле	АЦЦ		ААЦ	Асн	АГЦ	Сер ц
АУА		АЦА	Тре	ААА		АГА	А
АУГ Мет+Иниц	АЦГ		ААГ	Лиз	АГГ	Apr г
ГУУ		ГЦУ		ГАУ	д	ГГУ	У
ГУЦ	Вал	ГЦЦ	Ала	ГАЦ	Асп	ГГЦ	Ц Гли
ГУА		ГЦА		ГАА	г»	ГГА	А
ГУГ	+Иниц	гцг		ГАГ	Г лу	ГГГ	Г

Как видно из данных табл. 13.1, генетический код для аминокислот является вырожденным. Это означает, что подавляющее большинство аминокислот коди­руется несколькими кодонами; за исключением метионина и триптофана, по существу все остальные аминокислоты имеют более одного специфического кодона. Вырожден­ность кода оказывается неодинаковой для разных аминокислот. Так, если для серина, аргинина и лейцина имеется по 6 кодовых слов, то ряд других аминокислот, в част­ности глутаминовая кислота, гистидин и тирозин, имеют по 2 кодона, а триптофан — только 1. Следует отметить, что вырожденность чаще всего касается только третьего нуклеотида, в то время как для многих аминокислот первые два нуклеотида являются общими. Вполне допустимо поэтому предположение, что последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном специфичность каждого кодона, в то время как третий нуклеотид, очевидно, менее существен. В последнее время появились дока-

Таблица 13.1. Генетический код

Второй нуклеотид нодона

зательства гипотезы два из трех, означающей, что код белкового синтеза, воз­можно, является квази- или псевдодуплетным.

Имеются доказательства, что вырожденность генетического кода имеет несомнен­ный биологический смысл, обеспечивая организму ряд преимуществ. В частности, она способствует «совершенствованию» генома, так как в процессе мутации могут на­ступать различные аминокислотные замены, наиболее ценные из которых отбираются в процессе эволюции.

Другой отличительной особенностью генетического кода является его непрерыв­ность, отсутствие «знаков препинания», т. е. сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого. Другими словами, код является линейным, однонаправлен­ным и непрерывающимся: АЦГУЦГАЦЦ. Это свойство генетического кода обеспе­чивает синтез в высшей степени упорядоченной последовательности молекулы белков. Во всех других случаях последовательность нуклеотидов в кодонах будет нарушаться и приводить к синтезу «бессмысленной» полипептидной цепи с измененной струк­турой. Следует указать еще на одну весьма существенную особенность кода — его уни­версальность для всех живых организмов: от Е. coli до человека.

Из табл. 13.1 видно, что среди 64 мыслимых кодонов 61 имеет смысл, т. е. кодирует определенную аминокислоту. В то же время три кодона, а именно УАГ, УАА, УГА, оказываются «бессмысленными», нонсенс-кодонами, так как они не ко­дируют ни одной из 20 аминокислот. Однако эти кодоны не лишены смысла, по­скольку выполняют важную функцию в синтезе белка в рибосомах (функцию окон­чания, терминации синтеза).

При исследовании генетического кода в опытах in vivo были также получены доказательства универсальности кода. Однако в последние годы выяснены некоторые отличия кода в митохондриях эукариот животных, включая человека, отличающегося четырьмя кодонами от генетического кода цитоплазмы, даже тех же клеток. В частности АУГ, который обычно является инициаторным кодоном, кодирует также метионин в цепи, и УГА, являющийся нонсенс-кодоном, кодирует в митохондриях триптофан (см. табл. 13.1). Кроме того, кодоны АГА и АГГ являются для мито­хондрий скорее терминирующими, а не кодирующими аргинин. Как результат этих изменений, для считывания генетического кода митохондрий требуется меньше разных тРНК, в то время как цитоплазматическая система трансляции обладает полным набором тРНК.

Дата добавления: 2014-12-27