Этапы синтеза белка

Синтез белка представляет собой циклический энергозависимый многоступенчатый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детер­минированную последовательность с образованием полипептидов. Система белкового¹ синтеза, точнее система трансляции, которая использует генетическую информацию, транскрибированную в мРНК, для синтеза полипептидной цепи с определенной пер­вичной структурой, включает около 200 типов макромолекул — белков и нуклеиновых кислот. Среди них около 100 макромолекул, участвующих в активировании амино­кислот и их переносе на рибосомы (все тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы), более 60 макромолекул, входящих в состав 70S или 80S рибосом, и около 10 макромолекул (называемых белковыми факторами), принимающих непосредственное участие в си­стеме трансляции. Не разбирая подробно природу других важных для синтеза фак­торов, рассмотрим подробно механизм индивидуальных путей синтеза белковой мо­лекулы в искусственной синтезирующей системе. Прежде всего при помощи изо­топного метода было выяснено, что синтез белка начинается с N-конца и завер­шается С-концом, т. е. процесс протекает в направлении: NH2 -* СООН.

Белковый синтез, или процесс трансляции, может быть условно разделен на два этапа: активирование аминокислот и собственно процесс трансляции.

Активирование аминокислот

Необходимым условием синтеза белка, который в конечном счете сводится к по­лимеризации аминокислот, является наличие в системе не свободных, а так называе­мых активированных аминокислот, располагающих своим внутренним за­пасом энергии. Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи спе­цифических ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз в присутствии АТФ. Этот про­цесс протекает в две стадии:

Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом. На первой стадии амино­кислота реагирует с АТФ и образуется пирофосфат и промежуточный продукт, кото­рый на второй стадии реагирует с соответствующей З'-ОН-тРНК, в результате чего образуется аминоацил-тРНК (аа-тРНК) и освобождается АМФ. Аминоацил-тРНК располагает необходимым запасом энергии; она имеет следующее строение:

Необходимо еще раз подчеркнуть, что аминокислота присоединяется к конце­вому З'-ОН-гидроксилу (или 2'-ОН) АМФ, который вместе с двумя остатками ЦМФ образует концевой триплет ЦЦА, являющийся одинаковым для всех транспортных РНК.

Процессы трансляции

Второй этап матричного синтеза белка, собственно трансляцию, протекающую в рибосоме, условно делят на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация трансляции. Стадия инициации, являющаяся «точкой отсчета» начала синтеза белка, требует соблюдения ряда условий, в частности наличия в системе, помимо 70S (или 80S) рибосом, инициаторной аминоацил-тРНК (аа-тРНК), иниции­рующих кодонов в составе мРНК и белковых факторов инициации. Экспериментально доказано, что у бактерий, в частности у Е. coli, инициаторной аа-тРНК является формилметионил-тРНК, в образовании которой специфическое участие принимают соответствующая тРНК, обозначаемая тРНК*^Мет, и >}¹⁰-формил-тетрагидрофолиевая кислота (NiO-CHO-ТГФК):

Таким образом, N-формилметионил-тРНК является первой аа-тРНК, которая определяет включение N-концевого остатка аминокислоты и тем самым начало транс­ляции. Процесс формилирования имеет важный химический и биологический смысл, предотвращая участие Nbb-rpynnbi аминокислоты в образовании пептидной связи и обеспечивая тем самым синтез белка в направлении NH2 -»СООН. Образовавшаяся формилметионил-тРНК, по-видимому, первой связывается в определенном участке с 30S су б частицей рибосомы и с мРНК. Помимо тРНК^фМет, у Е. coli имеется обычная тРНК, акцептирующая свободный, а не формилированный метионин. Она обозначается тРНК^Мег и обеспечивает перенос метионина в процессе сборки (элон­гации) полипептидной цепи '.

Необходимым условием инициации является также наличие инициирующих ко-донов, кодирующих формилметионин. У бактерий эту функцию выполняют триплеты АУГ и ГУГ мРНК. Однако эти триплеты кодируют формилметионин (или началь­ный метионин) только будучи начальными триплетами при считывании матричной мРНК. Если же эти триплеты являются обычными, т. е. внутренними, то каждый из них кодирует свою аминокислоту, в частности АУГ-метионин и ГУГ-валин. Ясно, что инициаторный 5'-АУГ-кодон должен отличаться от других АУГ-кодонов. Пред­полагается, что инициаторному 5'-АУГ-кодону предшествует полипуриновая после­довательность, которая узнается полипиримидиновой последовательностью в моле­куле 16S рРНК. Возможно, кроме того, существование различий во вторичной структуре мРНК в районе инициирующего кодона, способствующих его узнаванию.

К настоящему времени выяснена природа белковых факторов инициации. У Е. coli открыты три таких инициирующих фактора, обозначаемых соответственно IF-1, IF-2, IF-3. Все они получены в высокоочищенном состоянии с примерными молекуляр­ными массами 9000, 100000 и 22 000 Да соответственно. IF-3 обеспечивает узнава­ние участка на мРНК, куда присоединяется формилметионил-тРНК. Этот белковый фактор первым связывается со свободной 30S субчастицей рибосомы. IF-1 способ­ствует связыванию формилметионил-тРНК с 30S субчастицей рибосомы и присоеди­нению к последней мРНК. Белковый фактор IF-2, вероятнее всего, способствует объединению 30S и 50S субчастиц после того, как на первой уже присутствуют инициирующие кодоны мРНК, N-формилметионил-тРНК, IF-3, IF-1 и ГТФ. Этот белок рассматривают как фактор стабилизации всего комплекса.

Аналогичные белковые факторы инициации обнаружены также в эукариотических клетках. Открыты около 10 эукариотических белковых факторов инициации, их при­нято обозначать elF. Хотя все они, по-видимому, важны для инициации, однако только три из них абсолютно необходимы для белкового синтеза — это eIF-2, eIF-3 и eIF-5; последние выделены в чистом виде, состоят из нескольких субъединиц: молекулярные массы их сильно различаются: от 86000 Да для eIF-2 и 160000 Да для eIF-З до 500000 Да для eIF-5. Укажем также, что в синтезе белка их роль тождественна роли инициаторных белков у прокариот.

Образование инициаторного комплекса. Экспериментально дока­зано, что в процессе белкового синтеза наблюдается постоянная диссоциация 70S рибосомы на 30S и 50S субчастицы и последующая их реассоциация. Сначала обра­зуется инициаторный комплекс путем присоединения белковых факторов, формил-метионил-тРНК и ГТФ к 30S субчастице рибосомы, к которой комплементарно антикодону формилмстионил-тРНК присоединяется мРНК при участии кодона АУГ (рис. 13.4).

Следует указать на особую роль формилметионил-тРНК, которая помогает мРНК найти на 30S субчастице определенное положение, обеспечивающее точную транс­ляцию информации о последовательности аминокислот в полипептидной цепи (уста­новление рамки). Как только мРНК присоединяется к комплексу, высвобождается белковый фактор IF-3; оставшийся комплекс легко присоединяет 50S субчастицу, образуя транслирующую, т. е. функционально-активную, 70S рибосому. В процессе этих перестроек рибосомы освобождают остальные белковые факторы инициации и продукты гидролиза ГТФ (ГДФ и неорганический фосфат), энергия которого рас­ходуется, по-видимому, на формирование инициирующего 70S комплекса рибосомы, в котором формилметионил-тРНК оказывается прикрепленной к пептидилсвязываю-щему центру рибосомы. В гидролизе ГТФ принимает участие IF-2. У образовав­шейся активной 70S рибосомы, содержащей формилметионил-тРНК, оказывается свободным аминоацильный центр, который может реагировать с определенной аа-тРНК, соответствующей очередному кодону мРНК. С этого момента начинается второй этап синтеза белка — элонгация.

Элонгация трансляции. Процесс элонгации полипептидной цепи у Е. coli непо­средственно, точнее топографически, связан с большой субчастицей (50S) рибосомы, содержащей два центра для связывания тРНК: один из них называется а м и н о-ацильным (А), другой — п е п ти ди л ь н ы м (П) центром (рис. 13.5).

В процессе элонгации у Е. coli также участвуют три белковых фактора EF-Tu, EF-Ts и EF-G (элонгационные факторы трансляции, сокращенно обозначаемые Ти, Ts и G); у эукариот известны два таких фактора, названных трансляционными фак­торами: TF-1 и TF-2. Почти все они получены в чистом виде — это белки с большой молекулярной массой (от 70000 до 200000 Да). Процесс элонгации требует также наличия ГТФ, энергия гидролиза которого необходима для сближения аа-тРНК, расположенной на аминоацильном центре, и формилметионил-тРНК, локализованной на пептидильном центре. Элонгация начинается со связывания следующей аа-тРНК (аминокислотный остаток которой является вторым с N-конца после формилметио-нина) с белковыми факторами и присоединения всего комплекса к аминоацильному центру в соответствии с кодовым триплетом на мРНК.

Далее в пептидильном центре осуществляется ферментативная реакция транс-пептидирования между формилметионил-тРНК и новой аа-тРНК; в процессе этой реакции остаток формилметионина переносится на свободную NH₂-rpynny аа-тРНК

и замыкается первая пептидная связь в будущей цепи; параллельно из пептидиль-ного центра освобождается тРНК*^Мет в цитозоль. Фермент, катализирующий эту реакцию, получил название пептидилтрансферазы (рис. 13.6); он входит в состав белков 50S субчастиц. Таким образом, в процессе транспептидазной реакции на А-центре образуется дипептидил-тРНК, а П-участок остается свободным, «вакант­ным».

Для дальнейшего процесса элонгации требуется освободить аминоацильный центр для присоединения следующей аа-тРНК. Для этого на следующей стадии благодаря процессу транслокации образовавшийся дипептидил-тРНК фрагмент переносится от аминоацильного на пептидильный центр. Достигается транслокация благодаря передвижению рибосомы относительно мРНК при участии фермента транслоказы (функцию которой выполняет фактор элонгации G у Е. coli и TF-2 у эукариот) за счет использования энергии распада еще одной молекулы ГТФ. В результате транслокации дипептидил-тРНК занимает место на пептидильном центре рибосомы, а аминоацильный центр, освободившись, может присоединить новую следующую аа-тРНК, соответствующую кодону мРНК. Укажем также, что в процессе транс­локации рибосома перемещается вдоль мРНК по направлению к ее З'-концу на рас­стояние в один кодон, т. е. точно на один триплет. На рис. 13.7 видно, что рибо­сома вступает в следующий цикл — происходит присоединение третьего аминокислот­ного остатка и т. д.

Таким образом, на стадии элонгации происходит последовательное наращивание полипептидной цепи по одной аминокислоте в строгом соответствии с порядком триплетов (кодонов) в молекуле мРНК.

Важным является вопрос о количестве энергии, необходимой для синтеза одной пептидной связи при биосинтезе белка. Как было отмечено выше, при активирова­нии аминокислоты еще до стадии инициации трансляции, т. е. при формировании аа-тРНК, расходуется энергия распада АТФ на АМФ и пирофосфат, что прибли­зительно эквивалентно гидролизу 2 молекул АТФ до 2 молекул АДФ. Для вклю­чения аминоацил-тРНК в аминоацильный центр используется энергия гидролиза моле­кулы ГТФ на ГДФ и неорганический фосфат. Наконец, транслокация транслирую­щей 70S рибосомы также нуждается в энергии гидролиза еще одной молекулы ГТФ. Таким образом, энергетические потребности синтеза каждой пептидной связи экви­валентны энергии гидролиза 2 молекул АТФ и 2 молекул ГТФ до соответствую­щих нуклеозиддифосфатов. Легко представить, насколько велики энерготраты каждой клетки при синтезе не только одной молекулы белка, а множества молекул самых разнообразных белков в единицу времени.

Терминация трансляции. Завершение синтеза полипептидной цепи в 70S рибосоме осуществляется при участии трех белковых факторов терминации. Эти белки обозна­чаются RF-1, RF-2 у прокариот. В клетках животных открыт единственный белок с аналогичным свойством — фактор R. Первые два фактора у Е. coli обладают свойством распознавания в молекуле мРНК терминирующих кодонов (УАГ, УАА

и УГА). После того как терминирующий кодон мРНК займет свое место в амино-ацильном центре рибосомы, к нему не присоединяется тРНК, отсутствуют анти-кодоны, узнающие этот терминальный сигнал, а присоединяется один из белковых факторов терминации и блокируется дальнейщая элонгация цепи. Считается, что терминирующие кодоны и белковые факторы индуцируют пептидилэстеразную актив­ность одного или двух рибосомных белков 50S субчастицы или что сами терми­нирующие факторы оказывают эстеразный эффект, причем гидролизуется сложно-эфирная связь между синтезированным полипептидом и тРНК. Следствием этого являются отделение белковой молекулы от рибосомы и освобождение тРНК и мРНК (последняя подвергается распаду до свободных рибонуклеотидов); одновременно 70S рибосома распадается на две субчастицы 30S и 50S, которые поступают в свобод­ный пул и могут вновь использоваться для реассоциации новой рибосомы. Схема­тически этот процесс представлен на рис. 13.8. ГТФ в терминации трансляции у Е. coli рассматривается в качестве аллостерического регулятора, а у эукариот ГТФ, вероятнее всего, распадается на ГДФ и Ф_н.

В общей форме зависимость между репликацией ДНК, транскрипцией и транс­ляцией мРНК представлена на рис. 13.9. Видно, что одна матричная мРНК транс­лируется не одной рибосомой, а одновременно многими рибосомами, расположен­ными близко друг к другу. Подобные «скопления» рибосом на мРНК получили название полирибосом или полисом; они значительно повышают эффектив­ность использования мРНК, т. е. ускоряют синтез белка.

Транспорт синтезированных белков через мембраны

Помимо использования белков для нужд самой клетки, многие так называемые экспортируемые белки, которые функционируют вне клетки, подвершются переносу через клеточную мембрану при помощи особых низкомолекулярных пептидов (от 15 до 30 аминокислот), получивших название лидирующих, или сигнальных, пеп­тидов. Особенностью их состава является преимущественное содержание гидрофоб­ных радикалов, что позволяет им легко проникать через бислойную липидную мембрану или встраиваться в мембрану. Эти сигнальные последовательности в рибо­сомах образуются первыми с N-конца при синтезе белка по программе сигналь­ных кодонов, расположенных сразу после инициаторного кодона, и легко узнаются рецепторными участками мембраны эндоплазматической сети. При этом образуется комплекс между мРНК, рибосомой и мембранными рецепторными белками, форми­руя своеобразный канал в мембране, через который сигнальный пептид проникает внутрь цистерны эндоплазматической сети, увлекая и протаскивая за собой синте­зируемую и растущую молекулу секреторного белка. В процессе прохождения или после проникновения полипептида в цистерны N-концевая сигнальная последователь­ность отщепляется под действием особой лидирующей (сигнальной) пептидазы, а зре­лый белок через пластинчатый комплекс (аппарат Гольджи) может покидать клетку в форме секреторного пузырька. Следует указать на возможность активного участия в транспорте белков и других полимерных молекул через мембраны, помимо сиг­нальных пептидов, также особых белков, получивших наименование поринов; хими­ческая природа и механизм их действия выяснены пока недостаточно.

Синтез митохондриальных белков

В митохондриях клеток высших организмов содержится до 2% клеточной ДНК, отличающейся от ДНК ядра. Митохондрии содержат весь аппарат, включая рибо­сомы, тРНК и мРНК, необходимый для синтеза определенных белков. Синтезируемые в митохондриях белки в основном относятся к нерастворимым белкам, участвующим в организации структуры этих органелл, в то время как источником синтеза рас-

творимых митохондриальных белков являются рибосомы цитоплазмы, откуда они затем транспортируются в митохондрии. Рибосомы в митохондриях имеют меньший размер, чем 80S рибосомы в цитоплазме. Интересно отметить, что в качестве ини­циирующей аминокислоты при синтезе белка в митохондриях эукариот может участвовать N-формилметионин, а не свободный метионин, как в цитоплазме. Это обстоятельство свидетельствует о том, что митохондриальный синтез белка по своему механизму, очевидно, близок к синтезу белка у прокариот.

Постсинтетическая модификация белков

Синтезированная на рибосоме в строгом соответствии с генетической програм­мой линейная полипептидная цепь уже содержит информацию конформационную, т. е. она претерпевает не хаотичные структурные изменения, а подвергается превра­щению в определенное трехмерное тело, которое само наделено информацией, но уже функциональной. Указанное положение справедливо для молекул белков, выпол­няющих в основном структурные функции, но не для биологически неактивных мо­лекул—предшественников белков, функциональная активность которых проявляется позже в результате разнообразных превращений, объединенных понятием п о с т-синтетическая, или пост трансляционная, модификация. Подобные моди­фикации структуры полипептида начинаются или сразу после трансляции, или во всяком случае еще до окончания формирования третичной структуры белковой моле­кулы. Помимо указанного выше процесса протеолитического удаления сигнального пептида, во многих белках отщепляется начальный N-концевой метионин. Оказалось, что в прокариотических клетках имеются особые ферменты, в частности деформи-лаза, катализирующая отщепление формильной группы от N-концевого метионина, а также аминопептидазы, катализирующие отщепление не только N-концевого фор-милметионина (или метионина у эукариот), но, возможно, и других остатков амино­кислот с N-конца пептида. Аналогичному, так называемому ограниченному пост­синтетическому протеолизу подвергаются проферменты (например, трипсиноген, химо-трипсиноген и др.) или предшественники гормонов (например, проинсулин, ире-Р-липо-тропин и др.).

Как известно, участок ДНК, несущий информацию о синтезе индивидуального белка, называется геном, а участок, контролирующий синтез единственной полипеп­тидной цепи,—цистроном. Следовательно, если в состав белка может входить не­сколько (более одного) полипептидов, то естественно предположить, что в синтезе такого белка должны участвовать несколько (более одного) цистронов. Однако это не всегда соответствует действительности, особенно в тех случаях, когда полипептид­ные цепи являются идентичными (например, а₂- и (3₂-цени НЬ). С другой стороны, если, например, пептидные цепи какой-либо белковой молекулы являются неиден­тичными, то это не всегда означает, что они синтезируются как результат действия разных цистронов. Подобный белок мог синтезироваться в виде единственной поли­пептидной цепи с последующими разрывами в одном или нескольких местах. Ти­пичным примером подобной химической модификации является гормон инсулин, син­тезирующийся в виде единого полипептида препроинсулина, который после фермен­тативного гидролиза превращается сначала в неактивный предшественник проинсу­лин, а затем в активный гормон инсулин, содержащий две разные полипептидные цепи (см. рис. 1.14).

Следует подчеркнуть, однако, что значительно больший удельный вес занимает посттрансляционная химическая модификация белков, затрагивающая радикалы аминокислот. Одной из таких существенных модификаций является ковалентное при­соединение простетической группы к молекуле белка; например, только после присо­единения пиридоксальфосфата к белковой части — апоферменту — образуется биоло­гически активная трехмерная конфигурация аминотрансфераз. Некоторые белки под­вергаются гликозилированию, присоединяя олигосахаридные остатки (образование

гликопротеинов). Широко представлены химические модификации белков, связанные с реакциями гидроксилирования остатков пролина, лизина (при формировании мо­лекул коллагена), реакциями метилирования (остатки лизина, глутамата), карбоксили-рования (остатки аспартата и глутамата) или ацетилирования ряда N-концевых амино­кислот. Одной из широко распространенных химических постсинтетических модифи­каций является фосфорилирование остатков серина, треонина, например, в молекуле гистоновых и негистоновых белков, а также казеина молока. Фосфорилирование не­которых остатков тирозина в молекуле белка в настоящее время рассматривается как один из специфических этапов формирования онкобелков при малигнизации нор­мальных клеток.

В заключение следует отметить, что хотя биосинтез белка, представляющий слож­ный многоступенчатый процесс, подробно описан во многих обзорах и моногра­фиях, однако наши знания о структурно-функциональных взаимоотношениях различ­ных его этапов все еще недостаточны. Действительно, выделены и охарактеризо­ваны рибосомы (более полно у Е. coli), состоящие из множества индивидуальных белков и трех типов молекул РНК; более того, выяснена аминокислотная последо­вательность всех 55 белковых молекул, как и первичная, и вторичная структура трех типов РНК, и интенсивно изучается трехмерная структура отдельных белков рибо­сом прокариот. Тем не менее многие существенные детали механизма белкового синтеза не ясны и наши знания находятся на уровне гипотез. Например, недоста­точно известно, какие участки или составные части рибосом ответственны за ини­циацию, элонгацию и терминацию белкового синтеза или каков молекулярный меха­низм процессов транслокации, пептидилтрансферазной реакции и взаимодействия рибо­сом с белковыми факторами, мРНК, тРНК и антибиотиками. Потребуется еще не­мало усилий для определения молекулярной архитектуры рибосом и отдельных ее составных частей, а также для получения точных данных об их структуре, форме и размерах, достаточных для понимания на молекулярном уровне функций рибо­сомы в сложном процессе синтеза белка.

Мультиферментный механизм синтеза пептидов. Матричный механизм синтеза лежит в основе синтеза почти всех белков живых организмов. Тем не менее синтез ряда низкомолекулярных пептидов может осуществляться не только без участия нуклеиновых кислот, в частности без мРНК, но даже при отсутствии рибосом. Еще на X Международном биохимическом конгрессе в Гамбурге в 1976 г. Ф. Липман (США) и К. Курахаси (Япония) представили экспериментальные доказа­тельства синтеза двух природных пептидных антибиотиков — грамицидина S и тиро-цидина в экстрактах, полученных из Bacillus brevis. В частности, выделенные из экст­рактов В. brevis две белковые фракции обеспечивали точность сборки циклического полипептида — грамицидина S, состоящего из 10 аминокислотных остатков, распо­ложенных в строгой последовательности. Очищенные белковые фракции (с молеку­лярными массами 100000 и 180000 Да) требовали присутствия только свободных аминокислот, АТФ и ионов Mg²⁺ для синтеза этого циклического декапептида (0-фенилаланилпролилвалилорнитиллейцин)₂:

D-Фен -> Про -> Вал -> Орн -> Лей

Дата добавления: 2014-12-27