Тонкослойная хроматография липидов

Экстракция липидов из биомассы дрожжей

Описание работы

Приборы и материалы

Лабораторная работа 13. Фракционирование липидов дрожжей методом тонкослойной хроматографии

В последнее время достигнуты большие успехи в разделении сложных смесей липидов на группы и индивидуальные вещества методом тонкослойной хроматографии. Наилучшим носителем явля­ется силикагель.

На данной работе студенты ознакомятся с некоторыми методами липидологии: экстракции липидов из ткани, тонкослойной хроматографии липидов с последующей окраской хроматограммы на специфические классы липидов.

Объектом исследования служат дрожжи и дрожжевой автолизат.

Для экстракции липидов используют смесь этанола и хлороформа, которая разрушает липидопротеидные комплексы и тем самым дает возможность достаточно полно извлечь липиды. Добавляя в гомогенат избыток хлороформа и воду, получают двухфазную систему, которую легко разделить. Слой хлороформа содержит растворенные в нем липиды. Разделение липидов на силикагеле зависит от их способности растворяться в подвижном растворителе.

1 Цель работы - провести тонкослойную хроматографию с соединений с последующей идентификацией групп липидов, входящих в состав экстракта дрожжей

Электроплитка

Аппарат для встряхивания

Центрифуга

Дрожжи

Смесь для экстракции (хлороформ: этанол: вода)

Смесь хлороформ: вода (1:1)

Хроматографические пластинки марки «Silufol»

Хроматографическая камера

Смесь растворителей петролейный эфир: бутиловый эфир уксусной

кислоты: уксусная кислота (70:30:1)

Раствор родамина Ж

Ультрафиолетовая лампа

Камера с парами йода

Раствор нингидрина в ацетоне 0,25 %

Биомассу дрожжей в количестве 0,5 г помещают в колбочку с пришлифованной пробкой (или пробирку с герметичной пробкой). Приливают 5 мл смеси для экстракции (хлороформ-этанол-вода). Колбочку помещают в аппарат для встряхивания на 30 мин. Полученную смесь центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин. Супернатант сливают в пробирку с пришлифован­ной пробкой. Полученный экстракт разбавляют 4 мл смеси хлороформа с водой (1:1). Энергично встряхивают 1-2 мин. После отстаивания и разделения слоев осторожно пипеткой отбирают хлороформенный нижний слой в сухой бюкс.

Для проведения хроматографии используют полученный экстракт суммарных липидов. Носителем является силикагель. В работе используют готовые пластинки марки «Silufol».

Перед нанесением пробы край пластинки, предназначенный для погружения в растворитель (нижний край), подвергают окан­товке, т.е. слой силикагеля шириной 3-4 мм полностью соскабливают скальпелем в виде ровной полоски. Затем приступают к разметке линии старта. Она должна отстоять от нижнего края слоя силикагеля на 1-1,5 cм. Эта линия намечается несколькими уколами иглы в слой силикагеля. Точки нанесения проб по стартовой линии должны отстоять от боковых краев пластины на 2-2,5 см. Расстояние между точками 2 см. Таким образом, на пластинку размером 9х12 cм экстракт наносится в 3 точки.

В местах нанесения не должно быть повреждений целостности слоя от прикосновения микропипетки (капилляра). Нанесения производят микропипеткой на 0,1 мл либо стеклянным капилляром. Хлороформенный экстракт липидов наносят порциями по 0,02 мл при помощи микропипетки либо капилляра на выбранную точку на пластинке. Всего наносят 0,1-0,15 мл экстракта. После каждого нанесения дают испариться хлороформу. При нанесении экстрак­та диаметр пятен не должен превышать 3-5 мм.

Пластинку после нанесения экстракта липидов помещают в стеклянную, плотно закрытую камеру, обложенную внутри фильтровальной бумагой, в которую предварительно налита подвижная фаза. Количество этой фазы должно обеспечить слой жидкости на дне камеры высотой 0,8-1,0 см. В качестве подвижной фазы употребляют смесь - петролейный эфир: бутиловый эфир уксусной кислоты: уксусная кислота (70:30:1 по объему). Пластинку устанавливают в камере под углом 45-60°С. Время разгонки 45-60 мин (зависит от температуры помещения). Фронт растворителя за это время должен подняться на 9-10 см. При вынимании пластинки из камеры отмечают иглой положение фронта растворителя (для последующего вычисления величины Rf).

Пластинку сушат под тягой на воздухе, разрезают на 3 равные части. Каждую полоску обрабатывают следующими методами:

Окраска родамином Ж. Одну часть высушенной хроматограммы помещают на 3-4 мин в раствор 0,002%-ого родамина Ж. Избыток красителя смывают водой и хрматограмму просматривают в ультрафиолете.

Окраска парами йода. Вторую часть пластинки помещают на несколько минут в камеру, насыщенную парами йода. На хроматогpaмме появляются желтые или коричневые пятна липидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты.

Окраска нингидрином. Третью часть пластинки помещают в раствор 0,25 % нингидрина в ацетоне. При нагревании в сушильном шкафу (t= 80⁰С) либо над электроплиткой появляются фиолетово-розовые пятна липидов, содержащих аминогруппы.

Дата добавления: 2015-04-24