Морфология форменных элементов. 2 страница

Азурофилы.

Азурофилы по размеру меньше моноцитов, имеют округлую форму и несегментированное ядро с компактным хроматином. Цитоплазма азурофилов выглядит красновато-бурой, но на самом деле окрашивается в бледный серо-голубой цвет. Красноватый оттенок ей придают многочисленные мелко- и грубозернистые азурофильные гранулы и нежные фибриллярные нити. В активированных клетках могут встречаться мелкие вакуоли и фагоцитированный материал. Азурофилы встречаются только у змей и ящериц, но далеко не у всех видов. Они вполне обычны у игуан. Эти клетки позитивно окрашиваются на пероксидазу, щелочную фосфатазу и селективный краситель нейтрофилов млекопитающих – Neutrocolor. Как уже обсуждалось выше, азурофилы разделяют морфологические черты нейтрофилов и моноцитов, но их функция явственно отличается от функции нейтрофилов млекопитающих. Они происходят из моноцитарного ствола и могут при определенных условиях морфологически преобразовываться в моноцитарный тип клеток (Will, 1978). У млекопитающих нейтрофилы также могут изменяться под воздействием инфекции и иногда совмещают фенотипические черты моноцитов и гранулоцитов. Клетки этого типа встречаются при лейкозе, классифицируемом как миеломоноцитарная лейкемия (Montali, 1988). У клинически здоровых ящериц количество азурофилов редко превышает 10% (в среднем 3-7%). Уровень азурофилов резко возрастает при антигенной стимуляции, особенно при моноцитарном ответе с участием IgM и IgY (Rosskopf, 2000). По нашему мнению, азурофилия – очень полезный маркер хронического гранулематозного воспаления. Так как у игуан их количество при воспалении значительно превышает количество моноцитов, изменение уровня азурофилов легче проследить в динамике. Schilling (1985) установил у ящериц 5 «групп гемограмм», характеризующихся моноцитозом и азурофилией: болезни печени, септическое воспаление, хронические инфекции, травмы и паразитозы. Вероятно, это справедливо и для других групп рептилий.

Общеклинический анализ крови (ОКА)

Общий объем крови у рептилий составляет приблизительно 5-8% от массы тела. У здорового животного можно без ущерба для него взять до 10% от общего объема крови, то есть у ящерицы массой 100 г можно взять около 0,7 мл. Разумеется, перед взятием крови не следует вводить животному химиопрепараты и кристаллоиды, тем более в тот же сосуд, из которого берется кровь. Кровь лучше брать из вены (технику венепункции см. в разделе «Инфузионная терапия») без антикоагулянта, или используя ЭДТА или литиевый гепарин. У млекопитающих в общеклинический анализ крови входят следующие исследования: определение гемоглобина, общего количества эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, а также вычисление цветового показателя, СОЭ и при необходимости таких расчетных показателей, как среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, средний объем эритроцитов, средняя концентрация корпускулярного гемоглобина. Для рептилий в ОКА обычно не определяют СОЭ и цветовой показатель, однако обязательно определяют гематокрит и иногда уровень фибриногена. Кровь, в зависимости от задач исследования и размеров пациента, берут в объеме 0,5-2 мл, как правило, из вентральной хвостовой вены с помощью шприца или вакутайнера с гепарином. ЭДТА (трилон Б) у рептилий и птиц вызывает гемолиз эритроцитов, и поэтому не рекомендуется для использования в качестве антикоагулянта. Это справедливо при выполнении биохимического исследования, однако в некоторых случаях ЭДТА может быть предпочтительнее, чем гепарин. Во-первых, любые гепарины, в том числе, литиевый, сильно меняют тинкториальные свойства клеток, особенно гранулоцитов. Во-вторых, гепарин может влиять на результаты некоторых визуальных колориметрических методов (особенно, определение общего белка) и определение гематокрита. По данным Hanley, et al (2003) ЭДТА при проведении ОКА у 32 игуан достоверно давал меньше погрешностей, чем гепарин. Таким образом, для проведения только общеклинического анализа предпочтительнее использовать ЭДТА, но если кровь одновременно используют для биохимического анализа, лучше использовать гепарин. Для приготовления тонкого мазка антикоагулянты лучше вообще не использовать.

После взятия в шприц кровь быстро переносят в центрифужную пробирку с сепарирующим гелем, а оставшуюся часть в объеме 100-200 мкл используют для подсчета общего количества эритроцитов и лейкоцитов, определения гемоглобина, гематокрита и приготовления тонкого мазка. Кровь у рептилий сворачивается в течение примерно 40 секунд, поэтому все растворы и посуда для исследования должны находиться под рукой, и действовать нужно быстро. В противном случае лучше пользоваться антикоагулянтом, хотя это может вызвать дополнительные артефакты.

Определение гемоглобина

Концентрацию гемоглобина можно определить цианметгемоглобиновым методом или в автоматических гемоглобинометрах. При этом сначала необходимо отделить фракцию свободных эритроцитарных ядер с помощью центрифугирования. Нормальные показатели для различных видов колеблются между 6 и 12 г/дл.

Подсчет общего количества эритроцитов

Общее количество эритроцитов можно подсчитать с помощью автоматического счетчика или вручную в гемоцитометре, одновременно с определением количества лейкоцитов. При этом для подсчета обоих типов клеток используют одинаковое разведение 1:200. Если в лаборатории нет специальной разводящей жидкости, то для подсчета эритроцитов кровь можно развести обычным изотоническим раствором хлорида натрия: 20 мкл крови разводят в 4 мл физраствора. Затем эритроциты подсчитывают в 5 больших квадратах камеры Горяева, разграфленных на 16 малых, используя фазовый контраст. Счет ведут по диагонали. Полученную сумму умножают на 10 000. В этом случае определяется количество клеток в 1 мкл (1 мм³) крови.

Подсчет общего количества лейкоцитов

Так как все форменные элементы крови рептилий имеют ядра, методы подсчета лейкоцитов, используемые для млекопитающих, не подходят для рептилий. Если откалибровать автоматический счетчик на средний размер лейкоцитов рептилий, то он будет фиксировать также импульсы от тромбоцитов, проходящих через капиллярное отверстие, поскольку они по размерам идентичны мелким лимфоцитам. В результате полученная цифра будет превышать реальное количество лейкоцитов как минимум вдвое, а чаще в 3-4 раза. Использование 3% раствора уксусной кислоты также не подходит, поскольку невозможно дифференцированно разрушить эритроциты и другие ядерные элементы крови рептилий, сохранив исключительно лейкоциты. Поэтому для подсчета общего количества лейкоцитов используют специальные разводящие жидкости, содержащие фиксатор и различные красители. В таком растворе фиксируются и сохраняются все форменные элементы крови, однако лейкоциты или некоторые их типы окрашиваются дифференцировано. Это позволяет отличить их от других клеток и подсчитать. На основании этого принципа разработано несколько методов прямого и косвенного подсчета лейкоцитов в гемоцитометре, а также есть несколько методов приблизительной оценки этой величины по тонкому мазку, по лейкоцитарной пленке в микрогематокритовой трубке и др.

- Модификация «классического» метода (Васильев, Балакина, 1999). В разводящей жидкости (жидкость Тюрка) повышают концентрацию уксусной кислоты до 15%. При этом происходит разрушение цитоплазмы тромбоцитов и эритроцитов без разрушения лейкоцитов (для некоторых видов рептилий такой концентрации оказывается недостаточно и ее необходимо повышать до 20%). Однако тени разрушенных клеток и их ядра остаются и мешают подсчету. Добавив к разводящей жидкости двойное количество метилового фиолетового, мы вызвали прокрашивание гранул крупных гранулоцитов, таких как азурофилы, гетерофилы и эозинофилы. Далее подсчет производится стандартным методом в камере Горяева.

- Метод Натта и Геррика (Natt, Herrick, 1952) был изначально разработан для подсчета клеток в крови цыплят и модифицирован Биндером для рептилий (Frye, 1991). Этот раствор (формула Натта-Геррика) содержит формалин, буферные компоненты и краситель – метиловый фиолетовый 2B. Состав разводящей жидкости приведен ниже в таблице.

Таблица Формула Натта-Геррика для подсчета общего количества лейкоцитов в крови рептилий и птиц.

NaCl Na2SO4 Na2HPO4: 12H2O KH2PO4 Формалин 36% метиловый фиолетовый 2B вода дистиллированная

3,88 гр 2,50 гр 2,91 гр 0,25 гр 7,50 мл 0,10 гр 1000 мл

Смесь разводят дистиллятом до объема 1 л, отстаивают в течение 12-24 часов и затем фильтруют через бумажный фильтр № 2. Пользоваться этим раствором можно в течение нескольких месяцев. К сожалению, он не выпускается в фабричной упаковке, и его нужно готовить самостоятельно. При подсчете клеток с помощью этого метода можно спутать лейкоциты с молодыми эритроцитами, так как оба типа клеток круглые и окрашиваются темнее. Можно также спутать у некоторых видов мелкие лейкоциты и тромбоциты. Ян Биндер (Frye,1991) обнаружил, что добавление 0,1 мл 1% раствора толуидинового синего к 10 мл жидкости Натта-Геррика непосредственно перед исследованием улучшает дифференциацию клеток.

- Метод с флоксином В. Этот метод, основанный на использовании коммерческого теста для определения количества эозинофилов млекопитающих (Eosinophil Unopett System), распространен в западных лабораториях. Краситель флоксин В, который содержится в разводящей жидкости, окрашивает гетерофилы и эозинофилы рептилий в ярко-красный цвет. Таким способом можно подсчитать их суммарное количество в 1 мкл крови. Затем по тонкому мазку считается суммарный процент этих клеток в лейкоцитарной формуле, и на основании этой цифры рассчитывается общее количество лейкоцитов в 1 мкл. Так как метод не является прямым, он может давать погрешность около 10%. Тем не менее, метод очень быстр, а главное, разводящую жидкость не нужно готовить самому. Поэтому его предпочитают частные врачи и коммерческие лаборатории, но в серьезных исследовательских центрах, разумеется, пользуются методикой Натта-Геррика, как более точной.

- Метод Риса и Экера. Готовый раствор (Rees&Ecker’s Solution) используют для подсчета тромбоцитов млекопитающих. Он производится на коммерческой основе и сохраняет стабильность не менее 6 месяцев. Раствор дифференцировано прокрашивает все клетки крови рептилий, хотя и менее ярко, чем при использовании методик, описанных выше. Метод был предложен Lawton, Divers (1999), однако не получил широкого распространения.

- Подсчет лейкоцитов по мазку. Это очень приблизительный метод, в англоязычной литературе именуемый LEFS (Leukocyte Estimate From Smear). Он включает подсчет лейкоцитов в моноклеточном слое крови тонкого мазка. Количество лейкоцитов считают в 10 или более полях зрения микроскопа при объективе × 40. Затем полученная сумма делится на количество полей зрения и умножается на 2000 (Fudge, 2000).По данным Centini, Klaphake (2002), проводивших сравнительную оценку результатов этого метода с методом Натта-Геррика, погрешность составляет около 16%, и результаты получаются, как правило, завышенными. Этот метод является самым простым, и не требует никаких дополнительных реактивов, однако, на наш взгляд, более чем приблизителен. В нескольких специально сравненных нами парных исследованиях погрешность составляла более 16%. Клетки крови в монослое мазка распределяются не равномерно, поэтому метод не может быть унифицирован. Все же, он позволяет выявить высокий лейкоцитоз или выраженную лейкопению, и может пригодиться врачу, вообще не имеющему контактов с лабораторией (например, в полевых условиях).

- Расчет общего количества лейкоцитов по толщине лейкоцитарной пленки. При определении гематокрита микрогематокритным методом кровью заполняют стандартный капилляр объемом 70 мкл и центрифугируют. В результате в капилляре происходит разделение эритроцитарной массы и плазмы. На поверхности эритроцитарного слоя, непосредственно под слоем плазмы, располагается тонкая лейкоцитарная пленка. Обычно она соответствует по толщине 1% общей гематокритной величины. Считается, что толщина пленки, равная 1% приблизительно соответствует общему количеству лейкоцитов 10 000/мкл. Увеличение толщины пленки на каждый следующий 1% соответствует увеличению общего количества лейкоцитов на 20 000 (Mader, 1999). То есть, если лейкоцитарная пленка занимает 2% гематокритной величины, то это приблизительно соответствует 30 000/мкл лейкоцитов. Lawton, Divers (1999) сравнивали этот метод с другими и выяснили, что некоторые корреляции наблюдаются только при исследовании крови змей. При этом толщина лейкоцитарного слоя около 0,5% соответствовала общему количеству лейкоцитов 6,8 тыс/мкл, а около 1% - 10,9 тыс/мкл. Таким образом, этот метод также является очень приблизительным, дает погрешность не менее 10%, и может быть рекомендован только для лабораторий, владеющих микрогематокритным методом, но не имеющих специальных реактивов для подсчета клеток в гемоцитометре.

В общем случае кровь для подсчета лейкоцитов (10 или 20 мкл) смешивают с разводящей жидкостью, добиваясь разведения 1:200, 1:100 или 1:20. Это «дело вкуса» специалиста, выполняющего анализ, однако следует помнить, что коэффициенты для подсчета в этих случаях будут отличаться. Затем кровь, смешанную с разводящей жидкостью, оставляют на 2-5 минут в видалевской пробирке или непосредственно в капилляре гемометра для лучшего окрашивания клеток, после чего еще раз взбалтывают и заполняют счетную камеру Горяева. Существуют разные мнения о количестве квадратов, в которых нужно считать клетки. Campbell (1996) рекомендует считать количество лейкоцитов в 10 больших квадратах, затем к полученному количеству прибавить 10% и умножить полученное число на 5000 (при разведении 1:200). Я предпочитаю считать лейкоциты в 100 больших квадратах (не разграфленных, объединенных по 4 – всего 25 штук) и затем полученную цифру умножать на 500. Это занимает больше времени, но дает меньшую погрешность.

Подсчет лейкоцитарной формулы

Лейкоцитарную формулу подсчитывают в окрашенном тонком мазке крови, микроскопируя его с иммерсионной системой. Для окраски мазков используют разные методы. Лучшим методом окраски крови, в том числе, для рептилий, считается окраска по Папенгейму. Для этого высушенный мазок на 3 минуты вносят в фиксирующую краску Май-Грюнвальда, затем промывают проточной водой и окрашивают по Романовскому в течение 20 минут. Существует также множество готовых модификаций окраски по Романовскому (Райт-Гимза, Нобль-Гимза, Гуголь-Гимза, Дженнер-Гимза и т.п.), которые используют в специализированных лабораториях. Для окраски этими методами мазок фиксируют в абсолютн6ом метаноле в течение 2 мин и затем окрашивают по выбранной методике от нескольких минут до 24 часов. Такие методы окраски, как Нобль-Гимза или Дженнер-Гимза позволяют сохранить мазки яркими в течение многих лет, и в основном используются для архивных целей (Frye, 1991). Для экспресс-окраски мазков в западных коммерческих лабораториях используют готовые модификации окраски азур-эозином: Diff-Quick или Dip Stat. В этом случае окраска мазков занимает всего 15 секунд. Мы также используем Diff-Quick для рутинных исследований, однако эталонные препараты всегда окрашиваем по Папенгейму. Для лучшей дифференциации клеток, особенно, если возникают сомнения о принадлежности нетипичных клеточных форм к определенному стволу гемопоэза, применяют селективные окраски серии Cytocolor из медицинской лабораторной практики (Cytocolor Inc. Hinckley, Ohio). Краска Lymphocolor используется для дифференциации различных типов лимфоцитов в мазках периферической крови и костного мозга. Granulocolor позволяет дифференцировать юные линии гранулоцитов. Neutrocolor позволяет дифференцировать азурофилы чешуйчатых. Megacolor специфично окрашивает мегакариоциты. Lysocolor позволяет выявить лизосомы в отдельных клетках гранулоцитарного ряда. Витальный краситель Panoptikon позволяет прижизненно окрашивать ядерный хроматин, нуклеолы и некоторые типы цитоплазматических гранул. Frye (1991) сообщает, что эти селективные красители, разработанные для окраски крови млекопитающих, дают вполне удовлетворительные результаты при работе с кровью и костным мозгом рептилий.

Определение гематокритной величины (PCV)

Стандартный капилляр для определения PCV микрогематокритным методом имеет объем 70 мкл, то есть такое количество крови можно взять у ящерицы массой всего 7 г. Гепаринизированный капилляр длиной 75 мм заполняют кровью до отметки 60 мкл и откручивают в микроцентрифуге в течение 3 мин при 5 тыс. об/мин. Для определения гематокрита у млекопитающих кровь центрифугируют в течение 5 мин при 8 тыс. об/мин. Это может вызвать разрушение крупных ядерных эритроцитов рептилий, и поэтому для них используют более мягкий режим центрифугирования. Результаты обычно определяют с помощью микрогематокритного счетчика или с помощью счетной шкалы, прилагаемой к центрифуге.

Расчетные величины MCV, MCH и MCHC

В случае анемий для дифференциальной диагностики рассчитывают такие величины, как средний объем эритроцитов (MCV), среднее содержание гемоглобина (MCH) и среднюю концентрацию корпускулярного гемоглобина (MCHC). Их можно определить по стандартным формулам, зная PCV (гематокрит), RBC (общее количество эритроцитов), и Hb (гемоглобин).

MCV=	PCV×10	;	MCH=	Hb×10	;	MCHC=	Hb×10
RBC	RBC	PCV

Эти величины уже были определены для многих видов рептилий. Для животных с анемией эти величины следует учитывать для характеристики эритроцитарной патологии.

Таким образом, общеклинический анализ крови различных видов ящериц можно выполнить разными методами. Нормальные показатели крови животных даже одного и того же вида могут варьировать в достаточно широких пределах. Кроме того, существуют значительные межвидовые вариации. Поэтому еще раз хочу сказать, что каждая лаборатория должна ориентироваться прежде всего на собственные «нормы», полученные на приличном серийном материале. В связи с этим мы не будем приводить здесь условные «нормы» для разных видов ящериц, а только несколько усредненные нормы для зеленых игуан (см. таблицу). Их вполне можно использовать для оценки «порядкового значения» собственных данных. Есть такая английская поговорка у врачей, которая переводится как «плохие лабораторные данные хуже, чем их отсутствие». Если полученные результаты существенно отличаются от приведенных здесь норм, значит либо выбранная методика не годится, либо у животного действительно серьезные отклонения. Такие исследования нужно обязательно повторять в динамике. Еще лучше использовать для контроля кровь клинически здорового животного того же вида. В любом случае, сравнение парных анализов с точки зрения диагностики будет более ценным, чем попытка сопоставить свои результаты с чужими литературными данными.

Таблица. Гематологические показатели, установленные для зеленых игуан (по данным разных авторов и на собственном материале).

Показатель	♂♂	♀♀	По нашим данным
Общее количество эритроцитов (х 10^6/мкл)	1,27­±0,23	1,48±0,19	0,8-2,0
Гемоглобин (г/дл)	9,1±5	10,7±1,5	3,5-5,5
Гематокрит (%)	33±4	38,2±4,4	24-37
Фибриноген (мг/дл)	117±39	130±67	84-160
Общее количество лейкоцитов (х 10^3/мкл)	15,2±6,4	13,3±5,7	4,5-10,0
Гетерофилы (%)	23±14	19±11	30-55
Лимфоциты (%)	63±14	69±16	40-55
Моноциты (%)	5±3	5±4	1-4
Эозинофилы (%)	1±1	1±1	0-2
Базофилы (%)	3±2	4±3	1-6
Азурофилы (%)	5±6	2±2	12-25

Дата добавления: 2015-03-29