Ферменттер биотехнологиясы 2 страница

Рекомбинантты ДНҚ технологиясы ең алғаш рет 1970ж.бактерияларда пайдаланылды. Рек.ДНҚ бұл бір организмнен екінші бір организмгегенетикалық ақпаратты тасымалдауға мүмкіндік беретін тәжірбиелік рәсімдер жиынтығы. Осы негізгі гендер кесіліп алынып, плазмидалық ДНК-ға енгізіледі. Мұны нысаналы ген д.а. Плазмида- ДНК бактерияларының шағын дөңгелек бөлігі. Рек.ДНК құрамына 2түрлі орг-нің ДНК-сы кіреді. Донор, реципиент. Рек.ДНК-дан кейін бактериялық клеткаға қайта мына жолдар арқылы енгізіледі: осмос қысымына тұз ерітіндісін қолд.арқ.,шыны инелермен микроиньекция жасау арқ., электропорация әдісі, температуралық шок.

2. Трансгенді жануарларды алу және олардың түрлі тишрін шығару

Трансгенді малдар – деп геном құрамына қосымша гендік мəлімет (трансген) жасанды жолмен ендірілген мал түрі айтылады. Мұндай жаңа мəлімет ретінде орналасуының өзіндік (гомологиялық) реттеу механизмдері (эукариоттық транскрипциялық бірлік) бар ДНҚ-ның жеке үлескісі, не болмаса ДНҚ-ның əртүрлі молекулаларынан жинастырылған (құрастырылған) гибридті (рекомбинантты) ген болуы мүмкін. Сол себепті трансген – бөгде

мал ағзасы ДНҚ-на тіркестірілген шығу тегі бөгде ген болып табылады. Сонымен қатар биотехнологияда трансгенез деген термин де жиі қолданылады. Трансгенез деп – жат текті (бөгде) генетикалық мəліметті белгілі бір мал геномына ендіріп тіркестіру үдерістері айтылады.

Генді микроиньекциялау. Трансгенді ауылшаруашылық малдарының алынғаны жөніндегі алғашқы мəліметті бір мезгілде АҚШ жəне Германия зертханалары қызметкерлері (Hammer et al., 1985; Brem et al., 1985) мəлімдеген болатын. Екі жұмыста да эмбриональдық желісіне құрастырылған генді ендіру үшін микроиньекция əдісі ұолданылған еді.

Гендерді микроиньекциялау арқылы трансгенді жануарларды алу үшін пронуклеус сатысындағы эмбриондарды хирургиялық жолмен не болмаса сойылған малдан алу қажет болады. Микроиньекциялау үшін қажетті

ұрықталған аналық жұмыртқасын алу мақсатында, əр мал түріне лайықты нұсқа бойынша суперовуляция шақырылып, наркоз салынған не болмаса өлтірілген хайуандардың жұмыртқа түтігін шаю арқылы аналық жұмыртқасы алынады.

3. Культивирленуші клеткалардың өзгергіштігі.

Агар косылған катты коректік ортада өсірген клеткалар сүйык ортада өсірген клеткаларға карағанда косымша метаболиттерді көбірек синтездейді. Тәжірибелер көрсеткендей, борпылдак каркынды өсетін каллуска карағанда тығыз баяу өсетін каллус клеткалары алкалоидтарды артык жинактаған, яғни әдеттегі метаболизм клеткалардын кеністікте әлдекандай үйымдасуын талап етеді. Сонғы кезде иммобильденген клеткалар өздеріне назар аударуда. Табиғи немесе жасанды сакгаушы затгардын беткі кабатына бекіген немесе полимерлік гельдер күрамына еніізілген, козғалысы шектелген осы ортада өсетін клеткалар иммобиль-денген деп аталады. Клеткаларды иммобильдендіру (козғалысын шектеу) олардын дифференциялануына жағдай туғызып, косымша заттарды көбірек синтездеуге жеткізеді. Иммобильденген клеткалар өзара тығыз байланыста өседі. Соның нәтижесінде олардын массасынын ішінде түтас организмдегідей, белгілі химиялык және физикалык градиенттер (бір бағытты өзгеру) пайда болады, ал олар метаболизм мен дифференциялануды реттейді. Сонда химиялык градиенттер деп гормондар, коректік заттар, оттегі, көміркышкыл газы мөлшері өзгеруін түсінуге болады. Клеткаларды мынадай төрт жолмен иммобильдеуге болады: 1) клеткаларды түрлі окшау (инерттік) заттармен каптау (альгинат, агар, полиакриламид, коллаген т.б.); 2) оқшау заттың беткі кабатына клеткаларды адсорбция аркылы орналастыру; 3) окшау заттьщ беткі кабатына клеткаларды биологиялык макромолекулалармен (лектиндермен) «тігу»; 4) клеткаларды коваленттік байланыстар аркылы окшау субстратка орналастыру (мысалы карбоксиметилцеллюлозаға).

1. Сомаклоналдық өзгергіштік факторлары

Сомаклондық өзгергіштік құбылысын генетикалық өзгергіштік деп түсінуге болады. Сомаклоналдық варианттар деп ин витро клеткаларды өсіргенде генетикалық өзгергіштік нәтижесінде пайда болатын, бастапқы өсімдіктен айныған регенерант өсімдіктерді атайды.Өсірілетін клеткалардағы қандай да болсын өзгергіштікті тек хромосомалардың саны өзгеріңмен,нүктелік мутацияларымен цитоплазмалық гендердің өзгерістерімен байланысты деп соңғы кездерге шейін есептеліп келеді. Сомаклондық өзгергіштік өте күрделі құбылыс.

Сомаклондық өзгергіштікті жан – жақты зерттеген австралиялық ғалым У.Скаукрофт пікірі бойынша, оның себептері кариотиптік өзгергіштікте,хромосомалық аберрациялады, гендердің амплификациясында немесе редукциясында.

Жасушаны өсірген кезде оның өзгергіштік ауқымына өсімдіктің генотипі қатты әсер етеді. Сомаклоналдық өзгеогіштік көптеген жағдайда генетикалық конституцияға байланысты. Сомаклоналдық өзгергіштік деңгейі қоретік ортаға отырғызылатын экспалнт алғашқы өсімдіктің қай мүшесінен: өркен төбесі, жапырақтың астыңғы жағы, сағақ, сабақ буыны, гүл бүршігі, жетілмеген бүршік, жарнақтар, тозаң

2. Метаболиттерді өндіру биотехнологиясы

Рекомбинантты ДНҚ технологиясы гендік инженерияның бір саласы.Гендік инженерияның мәні – жеке гендерді ір организмнен алып басқа организмге көшіп орналастыру. Бұған рестриктаза мен лигаза ферсменттері қатысады. Кейбір зерттеушілер РДТ гендік микрохирургия деп атайды, бірақ ол рестриктазалар мен лигаза ферменттері арқылы жүзеге асатын химиялық хирургия. Рестриктазалар – ДНҚ молекуласын белгілі жерлерден жеке үзінділерге қиып бөлшектейтін ыдыратушы фермент. аЛынған полинуклеотид бөлшектерінің комплементарлық немесе жабысқыш ұштарын ДНҚ лигазасы бір- бірімен желімдеп реттеп отырады.

Рестриктаза мен лигаза ферменттердің көмегімен бір ДНҚ молекуласынан қажетті ген бөлініп алынып, басқа ДНҚ молекуласының үзінділерімен құрастырылып рекомбинанттық, яғни жаңа будан ДНҚ жасалады. Одан кейін рекомбинанттық ДНҚ бірнеше әдістермен тірі жасушаға енгізіледі.

Бөтен генді жасуша ішіне тасымалдап алып баратын арнаулы ДНҚ молекуласын Вектор дейміз.Вектор ретінде бактериалды плазмидалар, хлоропласт және митохондрия ДНҚ-ы, вирустар мен вироидтар, транспозондар қолданылады.

РДТ:

1) Организмге көшірілетін құрылымдық генді бөліп алу

2) Генді вектордың құрамына енгізу, яғни рекомбинаттық ДНҚ жасау

3) Рекомьбинаттық ДНҚ-ын қожайын жасушасына тасымалдау.

4) Жасушаларда бөтен ДНҚ- ның экспессиясын талдау кезеңдерден тұрады.

Сонымен, жасущаға реомбинаттық ДНҚ молекуласы түрінде жаңа генетикалық

информацияны енгізіп, ақырында жаңа белгісі бар организмді алуға болады. Бұндай организмді трансгендік немесе трансформацияланған организм деп атайды, себебі бір организмнің өзгеріп басқа қасиетке ие болуын транформация дейді.

3. Донор малды қолдан ұрықтандыру

Мал шаруашылығында арнайы донорларды ұрықтандыру үшін екі əдіс қолданылады: 1. Табиғи жолмен; 2. Қолдан ұрықтандыру. Табиғи жолмен ұрықтандыруда – жұпатауға арналған малдар бөлектеліп алынып өз еріктерімен қашырылады (жыныстық қатынасқа түсіріледі). Қолдан ұрықтандыруда – аталық шауқатын донордың (аналықтың) жы- ныс жолына (жатырына) арнайы құралдар арқылы ендіреді. Зертханалық хайуандарменшағын денелі ауылшаруашылықмалдарының (қой, ешкі) эмбриондарын тасымалдау жұмыстарында оларды табиғи жолмен ұрықтандырса, ірі денелі малдарды, мысалы сиырды қолдан ұрықтандырады. Қолдан ұрықтандырудың қажеттілігі аталық шауқаттың құрамында сперматозоидтардың саны бір аналықты ұрықтандыруға қажетті мөлшерден анағұрлым көп болуынан туындайды. Ауыл шаруашылық малдарын қолдан ұрықтандыру келесі технологияларды қолдануды қажет етеді: – ұрықты алу; – ұрықты бағалау; – ұрықты араластыру (сұйылту); – ұрықты ағзадан тыс жерде сақтау; – ұрықты қолдану

Аталықтардан ұрықты арнайы аспап – жасанды қынап (вагина) арқылы алады. Алынған шауқаттың сапалық құрамы мұқият тексеріледі. Шауқат көлемі аталық малдарда 4-8 мл көлемінде болады. Бір малды ұрықтандыру үшін небəры 0,25-1,0 мл мөлшеріндегі шауқат жеткілікті болатындықтан, жаңадан алынған ұрықты пайдалану үшін оны сұйылтып араластыру қажет. Шауқатты 3-2°С температурада қысқа мерзімде сақтап, малды ұрықтандыру мақсатында пайдалану үшін, сұйылтып араластыру жұмыстарында глюко- за-цитратты-сарыуыз (ГЦС, немесе орысшасы глюкоза-цитратно-желточная -ГЦЖ), не болмаса сүтті-сарыуыз (СС, немесе орысшасы молочно-желточная- МЖ) ортасы пайдаланылады

1. Рекомбинантты ДНК технологиясындағы ферменттерді сипаттаңыз.

Бактериалды жасушаға ендірер алдында, молекулалық деңгейде клондауға арналған ДНҚ сегментінің (геннің) репликацияға қабілетті, яғни репликонды болуы қажет. Алайда ол мұндай қабілетке ие емес. Сондықтан олардың жасушаға тасымалдануы мен жасушадағы клондалған гендердің белгілі болып тұруын қамтамасыз ету үшін, оларды генетикалық векторлармен біріктіреді. Векторлар дегеніміз – гендерді пробиркадан биологиялық зерзатына тасымалдау жəне оларда қалыпты қызмет етулерін қамтамасыздандыруға қажетті генетикалық құрылым. Вектор ретінде плазмидалар мен фагтар бола алатындықтары жөнінде біздер білеміз. Плазмидалардың қандай да бір антибиотиктерге резистентті болуы бактерияларды осындай антибиотиктерге селекция жүргізуге мүмкіндік тудырады жəне рекомбинантты ДНҚ молекуласының оңай анықталуы себепті, олар жақсы векторлар болып саналады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын конструкциялауды, зерттелетін ДНҚ мен векторлық ДНҚ рестрикталарын алғаннан кейін бастау қажет болады. Мұның мəні – зерттелетін ДНҚ рестрикт сегментін (бөлшегін) векторлық ДНҚ рестриктасымен қосуға саяды жəне соның нəтижесінде олардың пішіні шеңберлі құрылымнан, ұштары «жабысқақ» болып келетін түзу сызықты ДНҚ бөліктеріне айналады. Кейіннен плазмидалық ДНҚ бөліктері лигаза ферменттерінің əсерімен сырттан əкелінген ДНҚ бөліктерімен қосылады. Нəтижесінде плазмида қайтадан шеңберлі 18 құрылымына ие болады. Мұндай жұмыстарда көптеген плазмидалар пайдалануы себепті, құрамында əртүрлі гендері бар ДНҚ комбинациялары түзілуі мүмкін.

Көптеген рестриктазалар, мысалы Eco R-І сияқтылар төрт негізден тұратын «жабысқақ» ұштыларды шығарады. Осындай төрт негізден тұратын «жабысқақ» ұштыларды лигирлеу төменгі температураларда (120С дейін) жүреді. Егерде рестрикциялау барысында «жабысқақ» ұшты бөлшектер пайда болмаса, оларды трансфераза ферменттерін қолдана отырып «жабысқақ» ұштыларға «мəжбүрлі» түрде айналдырады. Бұл фермент ДНҚ-ның 31 ұшына нуклеотидтерді қосады. Бір бөлшегіне поли-А құйрықшасы жалғанса, екіншісіне – поли-Т құйрықшасы жалғанады. Қажетті ұшты ДНҚ-ын алу үшін – полимеразды тізбектік реакциясы (ПТР немесе орысшасы – полимеразная цепная реакция – ПЦР) деген де қолданылады. ПТР-ның мəні – жасушадан бөлініп алынған ДНҚ-ын денатурациялау мен «күйдіру» жəне ДНҚ олигонуклеотидтерінің əрқайсысы 15-20 нуклеотидтерден тұратын ренатурацияланатын үзіктеріне жалғау болып табылады

2. Гаплоид өсімдіктерін алу әдістері мен селекциядағы маңызы

Табиғатта гаплойдтар апогамия гиногенез немесе андрогенез нәтижесінде мейоздың редукциялық бөліну барысында аталық немесе аналық жыныс жасушаларынан пайда болады.Редукцияланған апогамия ұрықтың синергидтер немесе антиподтардан пайда болуы.

Гиногенез аналық партоногенез-спермий тозаңдану кезінде жұмыртқа жасушасына енген сон ары қарай дамымайды,нәтижесінде ұрықтануға дайын,бірақ ұрықтанбаған жұмырқа жасушасы гаплойдтық ұрықты түзеді.

Андрогенез аталық партонегенез-спермий жұмыртқа жасушасына еніп,оның ядросын жарамсыз етеді.спермий ядросы жұмыртқа цитоплазмасымен бірге бөліне бастайды,оның нәтижесінде атадық хромосомалар жиынтығы бар гаплоидтық ұрық пайда болады.

Өсімдіктерді химиялық заттармен,иондаушы сәулемен және температураны күрт өзгертіп өңдеу,сәулелендірілген тозаңмен тозаңдандыру,алшақ будандастыруды қолдану-осының бәрі гаплойд алу үшін жасалғанымен,оның пайда болу дәрежесі өте төмен.Сондықтан бұл тәсілдер гаплойдты тұрақты түрде алуға мүмкіндік бермейді.

Қазіргі кездк гаплойдтарды алу үшін мынандай тәсілдер қолданылады

1) Псесдогамия-жұмыртқа жасушасын бөтен тозаңмен тозаңдандырған соң ол ұрықтанбайды,оның нәтижесінде гаплойдтық ұрық пайдв болады.

2)Гаплопродюсер тәсілі-будан ұрығында ата-аналар хромосомаларының бір жиынтығы іріктеліп жойылады.

3)Андрогенез және гиногенез in vitro тәсілдері-микроспоралар мен тозаңқапты (андрогенез),тұқым бүршік пен ұрық қалтасын (гиногенез) қоректік ортада өсіру арқылы гаплойдты өсімдігін алу

Фермент дегеніміз — белоктық зат, ол организмдегі түрлі химиялық реакцияларды тездетуші катализаторлар. Химиялық реакциялардың жүрісін тездетушілерді катализаторлар деп атайтыны белгілі. Фермент (латынның тілінде fermentum — ашу деген мағына береді) деген терминмен қатар әдебиетте энзим (грек тілінде — enzym, en — ішкі, zyme — ашытқы деген мағына береді) деген сөз де қолданылады.

Ферменттерді және олар катализдейтін реакцияларды зерттейтін биохимия бөлімі энзимология деп аталады. Ферменттер жөніндегі ілім қалай дамыды? Фермент қатысатын процестермен адам өте ерте кездерден бері-ақ таныс болатын. Тіпті ерте заманнын. өзінде-ақ қантты заттарды ашыту жолымен спирттік ішімдіктер алғаны белгілі. Ферменттер қатысатын про-цестерді ғылыми тұрғыдан зерттеу XVII ғатрдык орта кезінен басталады. Осы кезде Гельмонт қанты бар сұйық заттардың ашуы ерекше қоздырушылар көмегімен жүріетінін анықтаған. Осыдан кейін Лавуазье ашу кезінде қант түгелдей көмір кышқыл газға және спиртке айналатынын аныктады. XIX ғасырдың ортасында кейбір фермент препараттары (уыт-тан — амилаза, карын сөлінен — пепсин, т. 6.) бөлініп алынды. Сөйтіп, катализ және катализаторлар жөніндегі ілім жарықка шықты (Берцелиус және басқалар). Бұл кезде атқарылған зерттеу жұмыстары ферменттердің химиялық зат екенін, олардың негізі биологиямен байланысты екенін дәлелдеді. Луи Пастер спирттің ашу процесін зерттеп мынадай қорытындыға келеді: ашу процесін жүргізетін химиялық заттар емес, ашытқының, яғни тірі клеткалардың тіршілік әрекеті болып табылады. Ол ферменттер тірі ашыткыдан ажырамайды, олармен біртұтас деп санады. Ашуға қатысты мұндай көзқарас 1897 ж. Бухнер ашқан тамаша жаңалыққа дейін ұзақ уақыт сақталып, келді. Ол құрамында тірі клеткалар жоқ ашытқы сөлін сумен бөліп алады. Осы сөлдің өзі-ақ қантты тез ашытып, спиртке және көмір қышқыл газға айналдырғанын көреді. Осылайша қантты ыдыратып ашытатын ашытқының тірі клеткалары емес, керісінше олар жасап шығарған фермент (химиялық зат) екенін дәлелдейді. Ферменттің қантты ашыткы өнімдеріне айналдыратын катализатор екенін анықтайды. Спиртті ашу кезіндегі қатализатордын химиялык табиғатын анықтау ферментті процестер жөніндегі зерттеуді дамуға үлес қосқан үлкен күш болды және соның нәтижесінде көптеген ферменттер бөліп алынып зерттелді. Ферменттер әсерінің теориясы (Э. Фишер, 1890 ж.), ферментті реакциялардың кинетикасы (Л. Михаэлис пен М. Ментен, 1913 ж.) жөніндегі жұмыстар жарык көрді. XX ғасырдың бас кезінде И. П. Павлов және оның әріптестері ас қорытушы ферменттердің белоктық табиғаты жөнінде өте маңызды мәліметтер алады. Олар иттің қарынындағы сөлдің активтігі онын құрамындағы белоктарға байланысты екенін анықтады. Қарын сөлінде белок аз болса, онда пепсин де шағын мөлшерде болды. Өз мәліметтерін және баска да ғалым-дардың зерттеулерін талдай келіп, Павлов ферменттер дегеніміз — белоктық заттяр деген қорытындыға келді.Барлық басқа белоктар спяқты, ферменттер де химиялық кұрамы бойынша екі топка бөлінеді. Олар қарапайым ферменттер және күрделі ферменттер.

Қарапайым ферменттер дегеніміз — қарапайым белоктар, олар гидролиз кезінде амин қышқылдарына бөлінеді. Қарапайым ферменттерге мыналар жатады: рибонуклеаза, пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин, амилазалар жоне гидро-лаза класына жататын басқа да ферменттер.

Күрделі ферменттер дегеніміз — күрделі белоктар. Күрделі ферменттср екі беліктен: белоктык, жәнс белоктык емес бөліктен түрады. Ферменттердің белоктық бөлігі апофермент деп, ал белоктық емес бөлігі простетикалық топ немесе кофактор деп аталады. Апофермент кофакторсыз (простетикалық топсыз) активті болмайды. Күрделі ферменттердін, кофакторлары металл иондары немесе белоктық емес органикалык заттар. Мұндағы металл иондары активаторлар деп аталады. Активаторлар мына иондар: N8+, К+, Ғе²+, Ғе³⁺, Си²+, Со²⁺, 2п²^-, М§²+, Мп²⁺, Мі²⁺, Мо²-. 180 шамасынан астам ферментте металл иондары активатор қызметін атқарады.

Биохимиялық реакцияларда коферменттер екі турлі қызмет атқарады:

1. Күрделі фермент кұрамында субстраттың (субстрат деге-
німіз фермент әсер ететін зат) катализдік өңделіп өзгеруіне ка-
тысады, бұл кезде кофермент оның активті ортасына енеді;

2. Бір субстраттан екінші субстратқа (немесе баска фермент-
ке) электрондарды, протондарды немесе жеке химиялық топтар-
ды тасымалдайды.

Дата добавления: 2015-05-09