Приготовление растворов наиболее часто применяемых антикоагулянтов и противопоказания к их использованию в лабораторной практике

Для приготовления образцов цельной крови и плазмы используют вещества, которые препятствуют свертыванию крови, чаще всего путем связывания кальция.

Натрия оксалат

Приготовление раствора и его использование. 300 мг щавелевокислого натрия растворяют в 20 мл бидистиллированной воды. Используют 0,1 мл раствора на 2 мл крови. Иногда в пробирку на кончике скальпеля вносят сухой порошок натрия оксалат или калия оксалат (примерно 0,01 г).

Такой антикоагулянт нельзя использовать для определения электролитов (калий, натрий, кальций), щелочная фосфатаза, α-амилаза, рН крови.

Аммония оксалат используется редко.

Лимоннокислый натрий (тринатрийцитрат)

Приготовление раствора и его использование. Водный раствор концентрации 38г/л (с учетом навески кристаллизационной воды). Хранят в стеклянной бутылке с притертой пробкой, лучше в холодильнике при t 4⁰C. 1 объем раствора лимоннокислого натрия добавляют к 9 объемам крови.

Лабораторные тесты, определению которых мешает применяемый антикоагулянт: α-амилаза крови.

Этилендиамин-тетрауксусная кислота или ее динатриевая соль: ЭДТА-натрий (синонимы: селектон Б, хелатон, версен, трилон Б).

Приготовление раствора и его использование. 3 мг натрия этилендиамин-тетраацетата (динатриевая соль) растворяют в 20 мл бидистиллированной воды. На 2 мл крови берут 0,1 мл раствора, содержащего 1,5 мг антикоагулянта. Допускается всыпать ЭДТА в пробирку из расчета 1 мг порошка на 1 мл крови.

Преимущество – при морфологическом исследовании крови не сморщивает эритроциты.

Лабораторные тесты, определению которых мешает применяемый антикоагулянт: электролиты (калий, натрий, кальций), остаточный азот.

Гепарин (с активностью 1000 ЕД в 1 мл).

Приготовление раствора и его использование: 0,01 мл используют на 5 мл крови или 3 капли гепарина – на 10 мл.

Лабораторные тесты, определению которых мешает применяемый антикоагулянт: щелочная фосфатаза (снижение).

Соли гепарина (натрия гепаринат, калия гепаринат, лития гепаринат, аммония гепаринат) применяются редко.

Цитратно-глюкозная смесь (применяется для исследования метаболических, ферментативных процессов в эритроцитах, а также для определения активности кислой фосфатазы). Сложный антикоагулянт, готовиться специально.

Приготовление раствора и его использование. 4,7 г лимонной кислоты (химически чистой), 16 г трехзамещенного натрия цитрата, 25 г глюкозы растворяют в 1000 мл бидистиллированной воды. Берут 1 часть раствора на 4 части крови (учитывают разведение). Приведенные количественные соотношения могут быть уменьшены соответственно в 10 или другое количество раз.

Лабораторные тесты, определению которых мешает применяемый антикоагулянт: электролиты (калий, натрий, кальций), глюкоза.

Для получения сыворотки антикоагулянты не добавляют. Полученную кровь в пробирках, закрытых пробками, выдерживают некоторое время при t 37⁰С 10-15 минут. Затем осторожно проводят проволокой или стеклянной палочкой по внутренней стенке пробирки, чтобы ускорить получение сыворотки. Удерживая сгусток стеклянной палочкой, сыворотку сливают в центрифужную пробирку и центрифугируют. Получают бесцветную или желтоватую сыворотку.

Если сыворотка мутная, белая непрозрачная, это означает, что кровь была взята сразу после кормления, и ее использовать нельзя.

Если сыворотка розовая или красная, это означает, что в тромбе разрушились эритроциты и такую кровь для анализа использовать нельзя (кроме определения глюкозы).

Если сыворотку необходимо получить немедленно, то кровь центрифугируют сразу 15 мин при 1500 оборотов или 20 минут при 2000 оборотов.

Если сыворотка прозрачная, то повторного центрифугирования не надо. Обычно объем сыворотки при механическом отстаивании 1/3 от взятого объема крови; при центрифугировании – 3/4 объема крови.

Сыворотка отличается от плазмы отсутствием фибриногена (в плазме он есть, а в сыворотке нет), т.к. он переходит в тромб, превращаясь в фибрин.

Содержание электролитов правильнее определять в плазме крови.

Хранение. Обычно сыворотку крови держат в бытовом холодильнике при t 0…4 ⁰C. Можно замораживать и хранить в холодильнике без размораживания длительное время (для разных субстратов это время свое, например, активность щелочной фосфатазы при хранении в холодильнике увеличивается).

Биологический материал, взятый у одного пациента, называется образец. А часть образца для конкретного анализа – это проба.

ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ

Сложные процессы обмена веществ разделяют на ряд этапов.

Первый этап обмена начинается в органах пищеварения, где составные части кормов подвергаются разложению на более простые вещества, которые проникают через стенку кишечника в кровь и используются как энергетические и пластические материалы в организме.

Разложение кормовых веществ проходит в результате:

- действия пищеварительных ферментов

- действия микробов и простейших, населяющих полости пищеварительного тракта животного и обладающих ферментативными свойствами, способными вызывать глубокий распад питательных веществ корма и биосинтез биологически активных веществ.

У жвачных животных в процессах пищеварения особое значение играют бактерии и простейшие: в 1 г содержимого рубца находится до 10¹⁰ микробов и до 10⁵ – простейших типа инфузорий, которые, используя питательные вещества корма, синтезируют микробиальный белок, летучие жирные кислоты, витамины группы В, К и каротиноиды (предшественники витамина А).

Вторым этапом обмена веществ является межуточный обмен. Это сочетание многочисленных биохимических реакций синтеза, распада и взаимного превращения питательных веществ, всосавшихся в органах пищеварения и образующихся в организме. Процессы межуточного обмена протекают в клетках органов и систем на молекулярном уровне в их субклеточных структурах – в митохондриях, ядрах, эндоплазме, других внутриклеточных органеллах.

Третий этап – выделение продуктов обмена через кишечник (непереваренные остатки + метаболиты, поступившие из печени с желчью), с мочой, потом, молоком и выдыхаемым воздухом.

Характерной и важнейшей особенностью организма высокопродуктивных животных является интенсивное течение процессов обмена веществ и напряженная функциональная активность органов и тканей. Все процессы обмена веществ взаимосвязаны. Изменения их интенсивности и направленности в звеньях одного обмена отражаются, влияют на течения других видов обмена.

Энергетический обмен

Реактивность организма (ответная реакция) на все влияния внешней среды, в том числе и на условия питания, проходит ряд стадий и самым реактивным, и первично реагирующим на все воздействия является энергетический обмен (под влиянием нервной системы).

За счет энергии в организме животных совершаются все биохимические и физиологические процессы.

Образующаяся в процессах обмена веществ энергия используется для поддержания температуры тела, совершения работы, роста, развития организма, обеспечения функций структур клеток всех органов и систем, которые, в конечном счете, определяют продуктивность и здоровье животных.

40 % образовавшейся энергии идет на поддержание температуры тела, а 60 % - на синтез макроэргических соединений, главным из которых является АТФ (аденозинтрифосфорная кислота), уровень которой в организме определяется интенсивность процессов обмена веществ и проявление всех его физиологических функций.

Все пути обмена веществ и энергии взаимосвязаны между собой, а центром, в котором сходятся все метаболические пути, отдельные виды обмена, является ацетил-коэнзим А и цикл Кребса. Здесь соединяются углеводный, липидный и белковый обмены веществ.

Углеводный обмен

С кормом в организм животных углеводы поступают в виде полисахаридов (целлюлоза, крахмал, гликоген), дисахаридов (сахароза, лактоза у молодняка) и моносахаридов (глюкоза, фруктоза, галактоза у молодняка).

У моногастричных сахара начинают расщепляться уже в ротовой полости, а у жвачных в слюне амилазы нет. В рубце жвачных сахара под действием микробов превращаются в органические кислоты и всасываются частично через стенку рубца, используясь далее в межуточном обмене, превращаясь в энергию, в элементы тела и в продукцию животных.

Всосавшаяся в ЖКТ глюкоза в клетках тканей и органов, используя энергию фосфатной связи АТФ, превращается в глюкозо-6-фосфат, который идет на синтез гликогена или вновь на образование энергии в цикле Кребса.

Внутриклеточное окисление глюкозы состоит из большого числа реакций. Он включает 2 стадии

1)Анаэробная стадия заканчивается образованием ПВК и при отсутствии кислорода превращением её в молочную кислоту. При этом расходуется 1 молекула АТФ и образуется 4, т.е. 3 молекулы АТФ образуются вновь и могут использоваться на синтетические процессы.

2)Аэробный гликолиз. Если кислород имеется в достаточном количестве, то ПВК вступает в цикл Кребса с образованием еще 15 молекул АТФ, которые используются в жизнедеятельности организма.

Липидный обмен

Жиры всасываются в кишечнике в виде жирных кислот и глицерина и поступают вначале в жировые депо, где они в виде нейтрального жира могут составлять до 10-12 % массы тела. 1 г жира, «сгорая» в цикле Кребса, дает 9,5 ккал энергии. По мере необходимости они вновь переходят в кровь и используются в качестве энергетического или пластического материала. Разложение жирных кислот в тканях происходит в реакциях β-окисления, т.е. отщепления двух последних атомов углерода в виде активной уксусной кислоты, соединенной с ацетил-коэнзим А, который входит в цикл Кребса и распадается до углекислоты и воды.

Глицерин фосфорилируется и окисляется в гликолизе и в цикле Кребса по обычной схеме.

Ацетил-коэнзим А также образуется и при анаэробной стадии распада углеводов, следовательно, конечные стадии углеводного и липидного обменов протекают одинаково.

Наиболее активными и широко распространенными соединениями липидов являются фосфатиды (фосфолипиды, основным из которых является глицерин) и стероиды, которые входят в состав всех тканей и органов, и, в частности, один из них – холестерин (холестерол). Они составляют основную часть оболочек клеток, ядер, различных органелл; при этом холестерин крайне необходим в составе мембран, т.к. он определяет эластичность мембран или «текучесть». Они участвуют в процессах обмена белков, углеводов, липидов, преобразуются в половые гормоны, гормоны коры надпочечников, витамины группы D. Фосфолипиды способствуют всасыванию жиров, их транспортировке кровью, играют важную роль в органах размножения и при развитии зародыша.

Белковый обмен

Белкам принадлежит ведущая роль в обмене веществ. Обмен белков лежит в основе всех жизненных отправлений организма животных. Если липиды и углеводы используются в организме главным образом для образования энергии, то белки, после расщепления их на аминокислоты в кишечнике и всасывания, используются на синтез белков тканей всех органов, на биосинтез ферментов, гормонов и других биологически активных соединений.

Первым этапом синтеза белков в организме является активация аминокислот. Активация аминокислот протекает в гиалоплазме клеток при участии АТФ, ферментов и катионов Mg²⁺. При этом образуются богатые энергией активные вещества – аминоациладенилаты. На синтез белков клеткой используется более 90 % АТФ. Для образования 1 полипептидной связи необходима 1 молекула АТФ.

В процессах обмена белков аминокислоты подвергаются дезаминированию, аминированию, переаминированию и декарбоксилированию с образованием жирных кислот, которые в цикле Кребса окисляются до воды и углекислоты с выделением энергии (образуется 15 молекул АТФ).

При определенных условиях все аминокислоты (за исключением цистина, оксипролина, лизина, метионани, лейцина) через процесс глюконеогенеза могут превращаться в углеводы. Путь превращения аминокислот в углеводы лежит через образование пирувата (ПВК), который путем декарбоксилирования превращается в ацетат и через ацетилкоэнзим А используется для образования энергии макроэргических связей в цикле Кребса. Это свидетельствует о тесной связи белкового обмена с углеводным и жировым обменами.

Для обеспечения непрерывного процесса обновления, а также дополнительных количеств белка в тканях и крови постоянно находятся свободные аминокислоты, им отводится центральное место в белковом метаболизме. Сумму свободных аминокислот всего организма называют фондом или аминокислотным пулом организма. По сравнению с количеством аминокислот, находящихся в тканях в форме белков, количество их в свободном состоянии очень мало.

Аланин, цистеин, глицин, серин, треонин превращаются в ПВК, ацетил-коэнзим А à в цикл Кребса.

Изолейцин, лейцин, триптофан непосредственно превращаются в ацетил-коэнзим А à цикл Кребса.

Фенилаланин, тирозин, лейцин, лизин, триптофан превращаются в ацетоацетил-коэнзим А, он – в ацетил-коэнзим А à в цикл Кребса.

Аспартат, аспарагин превращаются в щавелевоуксусную кислоту à в цикл Кребса.

Кроме того, фенилаланин и тирозин могут превращаться в фумаровую кислоту.

Изолейцин, метионин, валин могут превращаться в сукцинил-коэнзим А.

Аргинин, гистидин, глутамин, пролин через глутамат превращаются в α-кетоглутаровую кислоты, она – в янтарную кислоту и далее в цикл Кребса.

СУБСТРАТ – БЕЛОК

Дата добавления: 2015-06-04