Лабораторно-практическое занятие №7

Тема: Извлечение флавоноидов.

Цель: Выделить флавоноидов из растений и проведение с ними качественных реакции.

Опыт №1 Извлечение катехинов из зеленого чая

Дубильные вещества чая представляют собой смесь нескольких катехинов и их эфиров. Главные компоненты смеси: эпикатехин, галлокатехин, их эфиры с галловой кислотой. Например, танины из листьев цейлонского чая содержат эпикатехин (6,5%о), галлокатехин (24,2%), эпикатехингаллат (9%) и галлокатехингаллат (49%). Самих же танинов в зеленом чайном листе —22—24°/о, в черном чае —14—17% от веса сухих веществ. Катехины чая — негидролизующиеся дубильные вещества. От нагревания с разбавленными кислотами они превращаются в нерастворимые продукты уплотнения, так называемые флобафены. Обладают Р-витаминным характером, т. е. являются капилляроукрепляющими препаратами и вместе с тем способствуют накоплению аскорбиновой кислоты в организме.

Оборудование и реактивы:

1) Коническая колба.

2) Водяная баня.

3) Воронка и фильтр.

4) Штатив с пробирками.

5) Зеленый чай.

6) Ацетат свинца.

7) 1% раствор серной кислоты.

8) Этилацетат.

9) Водный раствор хлорного железа.

10)Раствор ванилина.

11)Концентрированная соляная кислота.

Ход работы.

Неферметированный чай загружают в коническую колбу (500 мл), заливают 300 мл горячей воды и нагревают 1 час на кипящей водяной бане. Раствор отфильтровывают через полотняный фильтр на фарфоровой воронке, а остаток обрабатывают повторно водой. К объединенному экстракту добавляют ацетат свинца до полного осаждения таната свинца. Темный осадок отфильтровывают, промывают водой, обрабатывают 1-процентным раствором серной кислоты до явно кислой реакции. Сульфат свинца отфильтровывают, раствор промывают три раза этилацетатом (порциями по 20 мл). Этилацетат отгоняют на водяной бане; остаток высушивают. Полученный танин измельчают в порошок и взвешивают. Выход 3—4 г. Танин из зеленого чая представляет собой аморфный порошок, легко растворимый в воде и спирте.

Качественные реакции. Часть танина растворяют в воде, раствор разливают в три пробирки и проводят качественные реакции, доказывающие его принадлежность к дубильным веществам катехинового ряда.

1. С водным раствором хлорного железа—зелено-черное окрашивание.

2. С раствором ванилина в соляной кислоте — малиновое окрашивание.

3. Нагревание пробы с каплей концентрированной соляной кислоты — красный осадок флобафена.

Опыт № 2. Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин травы зверобоя продырявленного, собранной в разные фазы вегетации: бутонизации, цветения, плодоно­шения, увядания

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 50 % спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин., периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещают в колбу для экстрагиро­вания и прибавляют 30 мл 50 % спирта. Экстракцию повторяют еще дважды в описан­ных выше условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят 50 % спиртом до метки и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора алюминия хлорида в 95 % спирте и доводят объем раствора 95 % спиртом до метки. Через 40 мин. изме­ряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенной 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Государственного стан­дартного образца (ГСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в перерасчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле (1.2.3):

X = (1.2.3),

где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D₀ – оптическая плотность ГСО рутина; m – масса сырья, г; m₀ – масса ГСО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %.

Примечание: Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушен­ного при температуре 130-135 °С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95 % спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, коли­чественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Результаты:

D₀ = 0,335

m₀ = 0,05

Период бутонизации:1) m₁ = 1,1166

D₁ = 0,325

W₁ = 7,72 %

X = = 4,71 %

Период цветения: 1) m₂ = 1,0024

D₂ = 0,394

W₂ = 5,94 %

X = = 6,24 %

Период плодоношения: 1) m₃ = 1,0107

D₃ = 0,337

W₃ = 6,05 %

X = = 5,3 %

Период увядания: 1) m₄ = 1,0183

D₄ = 0,324

W₄ = 5,53 %

X = = 5,03 %.

Опыт № 3 Качественное обнаружение флавоноидов в образце череды трехраздельной.

Для качественного обнаружения флавоноидов в исследуемом объекте - траве череды трехраздельной - готовим спиртовое извлечение. Для этого в колбу с притертой пробкой вместимостью 25 мл помещают 0,5 г измельченного сырья, прибавляют 5 мл 70 % спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Содержание колбы охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр (раствор Б).

На полоску хроматографической бумаги FN 12 (ГДР) наносят микропипеткой 0,02 мл раствора Б. Бумагу подсушивают на воздухе и хроматографируют при комнатной температуре в вертикальной камере, предварительно насыщенной в течение 24 ч смесью растворителей н-бутиловый спирт-уксусная кислота - вода (4:1:2). Через 16 ч хроматограмму вынимают, сушат до полного исчезновения запаха растворителей и просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме должно быть два темно-коричневых пятна с Rf около 0,38 и 0,58 (флавоноиды). Не допускается наличие темно-коричневого пятна с Rf около 0,75 (примесь череды поникшей).

Библиография

1. Алейникова Т. Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М.: Высшая школа, 1988. – 189с.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Просвещение, 1990. – 524с.

3. Зинковский А. Ф. Практикум по биологической химии для студентов.- Ульяновск, 1984. - 236с.

4. Каспржак А. Г. Элективные курсы в профильном обучении. – М.: Просвещение, 2004. – 97с.

5. Колотилова Л. И. Витамины. – М.: Высшая школа, 1976. – 254с.

6. Лазурьевский Г. В., Терентьева И. В., Шамшурин А. А. Практические работы по химии природных соединений.- М.: Высшая школа, 1961. – 191с.

7. Ленинджер А. Основы биохимии; В 3 т. М.: Мир, 1985. Т. 1-3. - 1056 с.

8. Логинова О. Б. От «углубленки» к профильному обучению// Химия в школе. 2006. № 32. - с. 14 - 17.

9. Макаров К. А. Химия и медицина. – М.: Просвещение, 1981.- 164с.

10. Меньшиков В. В. Биохимия.- М.: Просвещение, 1986. - 489с.

11. Наливайко Л. П., Астафьев В. М., Наливайко И. В. Биологическая химия с основами экологии: Часть II.- Самара: Изд-во СамГПУ, 2001. – 72с.

12. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. - 815с.

13. Панфилова Л. В. Химия окружающей среды: Часть 4. Органическая химия.- Самара: СИПКРО, 2000. - 50с.

14. Пустовалова Л. М. Практикум по биохимии.- Ростов-на-Дону: издательство «Феникс», 1999. – 544с.

15. Руководство к лабораторным занятиям по органической химии: Пособие для вузов/ Н. Н. Артемьева, В. Л. Белобородов, С. Э. Зурабян и др. – М.: Дрофа, 2002. – 384с.

16. Страйер Л. Биохимия: В 3 т. М.: Мир, 1984 - 1985. Т. 1- 3. - 936 с.

17. Файгль Ф. Капельный анализ органических веществ.- М.: Госхимиздат, 1962. – 836с.

18. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1985. – 503с.

19. Филиппович Ю. Б. Практикум по биохимии.- М.: Просвещение, 1982. – 311с.

20. Черникова Н. Г. Профильное обучение. – М.: ТЦ Сфера, 2006. – 293с.

Приложение 1.

Дата добавления: 2015-06-29