Внутриклеточный транспорт белков по ЭР и аппарату Гольджи можно проследить с помощью

радиоавтографии [3]

Методы изучения транспорта белков внутри клетки были разработаны в 60-е гг. и впервые применены для наблюдения транспорта из ЭР во внеклеточное пространство в секреторных клетках поджелудочной железы.

Специализированные секреторные клетки, такие, как ацинарные клетки поджелудочной железы, содержат большие количества белкового секрета, заключенного в секреторные везикулы (пузырьки). При стимуляции клетки внешним сигналом содержимое этих пузырьков быстро выбрасывается во внеклеточное пространство путем экзоцитоза. Этот процесс известен как регулируемая секреция. Его следует отличать от конститутивной секреции, представляющей собой другую форму экзоцитоза, происходящего постоянно, в отсутствие стимулирующего сигнала.

Ацинарные клетки поджелудочной железы секретируют различные пищеварительные ферменты (амилазу, липазу, дезоксирибонуклеазу и рибонуклеазу), а также предшественники ферментов, так называемые зимогены (например, трипсиноген и химотрипсиноген). Эти предшественники активируются в результате их специфического расщепления протеазами.

Благодаря тому, что группа белков, синтезируемых в ацинарных клетках поджелудочной железы, предназначена для секреции, мы можем судить о пути их передвижения от места синтеза к месту высвобождения. Этот путь можно проследить, сочетая радиоавтографию с электронной микроскопией. Схема соответствующего эксперимента представлена на рис. 8-5. Если клетки кратковременно проинкубировать с [3Н]-

аминокислотами (импульсное мечение), а затем различное время выращивать в нерадиоактивной среде, то новосинтезированные белки в первую

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 8-5. Схема, объясняющая, как с помощью электронномикроскопической радиоавтографии можно проследить путь секреторных белков, в состав которых входят [3Н]-меченные аминокислоты. Важно, чтобы все свободные радиоактивные аминокислоты были отмыты до заключения и единственным радиоактивным источником в ткани оставались белки. Затем ткань покрывают тонким слоем фотоэмульсии.

Электроны, испускаемые тритием, засвечивают зерна серебра в положениях, несколько смещенных по отношению к источнику излучения, поэтому локализация радиоактивной молекулы определяется менее точно, чем позволяет разрешение электронного микроскопа.

очередь выявляются в ЭР, а затем в аппарате Гольджи (рис. 8-6). Позднее [3Н]-белки обнаруживаются в больших, незрелых секреторных везикулах вблизи стопки Гольджи (рис. 8-7), где они все более концентрируются; в результате формируются зрелые пузырьки, хорошо различимые на электронных микрофотографиях благодаря их электроноплотному содержимому (рис. 8-7 и 8-8).

Секреторные везикулы накапливаются в апикальной части ацинарной клетки (т. е. в части, обращенной к системе протоков) между аппаратом

Рис. 8-6. Электронномикроскопическая радиоавтография ацинарных клеток поджелудочной железы, импульсно меченных [3Н]-

аминокислотами и затем инкубированных различное время в немеченной среде ("pulse-chase''-метод). С течением времени зерна восстановленного серебра (выделены цветом) перемещаются по направлению к внеклеточному пространству, указывая путь, по которому следуют вновь синтезированные молекулы секреторных белков. Ацинарные клетки необычны тем, что 85% синтезируемых в них белков секретируется; пока клетка не стимулирована к секреции, эти белки сохраняются в секреторных пузырьках.

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 8-7. Электронная микрофотография аппарата Гольджи в ацинарной клетке поджелудочной железы, на которой видны секреторные пузырьки на разных стадиях созревания. Незрелые секреторные пузырьки (называемые в этих клетках конденсирующими вакуолями)

отпочковываются от аппарата Гольджи. Секреторные белки в этих пузырьках становятся все более концентрированными (отсюда и название «конденсирующая» вакуоль), что в конечном счете приводит к преобразованию конденсирующих вакуолей в зрелые секреторные пузырьки (вверху слева). Эти секреторные пузырьки в ацинарных клетках поджелудочной железы называют зимогеновыми гранулами. (С любезного разрешения George Palade.)

Гольджи и плазматической мембраной. Когда пузырек сливается с плазматической мембраной, его содержимое попадает во внеклеточное пространство. Эти пузырьки сливаются только с апикальной частью плазматической мембраны, тем самым исключается бесполезное и опасное выделение секрета в межклеточное пространство или в полость других органелл. Более того, экзоцитоз происходит только в ответ на соответствующий внеклеточный химический сигнал, подаваемый нервными клетками или клетками кишечника тогда, когда для пищеварения требуются панкреатические ферменты. Изучено множество секреторных белков из различных типов клеток. Оказалось, что все они проходят один и тот же путь: рибосома → ЭР → аппарат Гольджи → внеклеточное пространство. Те белки, которые должны остаться в плазматической мембране, лизосомах или цистернах аппарата Гольджи, тоже сначала попадают в ЭР и затем оттуда через аппарат Гольджи направляются к местам конечной локализации.

Для выявления более тонких деталей метаболических путей, начинающихся в ЭР, необходимы более сложные методы. Некоторые из попавших в ЭР белков остаются там для выполнения ферментативных функций. Большинство же белков упаковывается в транспортные пузырьки (обычно 50-100 нм в диаметре), которые затем отшнуровываются в специальных местах мембран ЭР, называемых переходными элементами (рис. 8-

9), и специфически сливаются с ближайшей цистерной аппарата Гольджи. После слияния мембрана пузырька становится частью мембраны аппарата Гольджи, а растворимые белки содержимого пузырька доставляются в полость цистерны Гольджи (рис. 8-10). Таким способом растворимые белки избирательно переносятся из одного окруженного мембраной компартмента в другой без проникновения сквозь мембраны.

Полагают, что с помощью такого же механизма отделения и слияния пузырьков белки переносятся из одной цистерны Гольджи в другую, и затем к различным местам конечного назначения, в соответствии с их различными функциями. На этом пути белки проходят через целую серию замкнутых пространств, топологически эквивалентных друг другу и внеклеточному пространству (рис. 8-11).

На каждом этапе метаболизма белки совершают выбор - остаться в цитозоле или проникнуть в ЭР, остаться в ЭР или поступить в аппарат Гольджи, стать содержимым транспортных пузырьков, направляющих-

Рис. 8-8. Электронная микрофотография очищенного препарата крупных секреторных пузырьков. Такие пузырьки встречаются в специализированных секреторных клетках. (С любезного разрешения Daniel S. Friend.)

Рис. 8-9. Транспортные пузырьки отпочковываются от особых областей ЭР, почти свободных от рибосом. Эти области называются переходными элементами. Пузырьки сливаются с ближайшей цистерной Гольджи, перенося, главным образом, вновь синтезированные белки и липиды от ЭР к аппарату Гольджи. (С любезного разрешения Brij J. Gupta.)

Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К. Уотсон Дж. Д. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд. перераб. и доп. Т. 2.: Пер. с англ. – М.: Мир, 1993. – 539 с.

Рис. 8-10. В процессе везикулярного транспорта сохраняется расположение «сторон» мембран. Обратите внимание, что в мембране компартмента-мишени сохраняется исходная ориентация как белков, так и липидов, а растворимые материалы переносятся из просвета в просвет.

Рис. 8-11. Схема клетки, в которой топологически эквивалентные области выделены цветом. В принципе, циклическое отпочковывание и слияние пузырьков позволяет связать просвет (полость) любой органеллы с другим просветом и с внеклеточным пространством. Однако некоторые органеллы (например, митохондрии и хлоропласты) не связаны с другими органеллами везикулярным транспортом. Таким образом, они изолированы от изображенных здесь транспортных путей между органеллами.

ся к лизосомам, или вместо этого попасть в пузырьки, перемещающиеся к клеточной поверхности, и так далее. Выбор в каждом случае зависит от аминокислотной последовательности молекулы белка, содержащей сигналы сортировки, которые определяют путь белка внутри клетки.

Дата добавления: 2015-08-31