Токсикокинетика. Метаболические маркеры

Онкомаркеры.

Онкомаркеры – это особые белки, которые обнаруживаются в крови и моче больных раком. Опухолевые клетки продуцируют и выделяют онкомаркеры в кровь с момента возникновения новообразования, что делает возможным диагностику заболевания на ранних стадиях. Они представляют собой специфические вещества, которые образуются в результате жизнедеятельности раковых (а иногда и нормальных) клеток и обычно обнаруживаются в крови.

Онкомаркеры чрезвычайно многообразны по своей структуре, хотя в большинстве случаев являются белками или их производными. Некоторые из них обладают высокой специфичностью, т.е. характерны для одного вида опухоли, некоторые могут обнаруживаться при различных типах злокачественных новообразований.

Онкомаркерам присваиваются нумерованные названия, например, СА 19-9 для рака поджелудочной железы, СА 15-3 – для рака молочной железы и СА125 – для рака яичников.

Анализ на онкомаркеры не только один из надежных способов обнаружения злокачественной опухоли, но и возможность оценить эффективность проводимого лечения. Рецидив злокачественных заболеваний можно предвидеть за несколько месяцев до начала клинических проявлений.

Благодаря специфичности каждого белка можно предположить очаг заболевания. Каждое новообразование выделяет строго определенный белок. Известно около 200 соединений. Относящихся к опухолевым маркерам, но диагностическую ценность из них имеет не более 20.

Наиболее часто проводят анализы на следующие виды онкомаркеров:

1. Онкомаркер ПСА (простатическийспецифический антиген простаты общий и свободный) присутствует в здоровой, чрезмерно развитой и трансформированной ткани простаты. Это самый специфичный и чувствительный антиген, позволяющий диагностировать рак предстательной железы. Повышение уровня PSA может указывать на р ак предстательной железы (около 80% случаев), доброкачественная гиперплазия предстательной желез (небольшое повышение), воспаление или инфекция в простате, ишемия или инфаркт простаты, эякуляция накануне исследования, хирургическое вмешательство, травма или биопсия предстательной железы.

2. Онкомаркер CA 125

Основной маркер рака яичников и его метастазов. В норме концентрация онкомаркера в крови - 0-30 МЕ/мл. Повышенный уровень CA 125, более 30 МЕ/мл может указывать на злокачественные заболевания яичников (преимущественно), матки (внутреннего слоя - эндометрия), молочной железы, поджелудочной железы (в комбинации с СА 19-9)

3. Онкомаркер СА 19-9

Онкомаркер СА 19-9 – маркер поджелудочной железы, желчного пузыря, маркер карциномы поджелудочной железы. Патологической считается концентрация в крови 40 МЕ/мл и выше. Повышенный уровень этого маркера является плохим прогностическим признаком у больных раком толстой и прямой кишки. Повышение уровня СА 19-9 указывает на рак поджелудочной железы, рак желудка, рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак желчного пузыря

4. Онкомаркер СА 15-3 (Муциноподобный гликопротеин)

Онкомаркер молочной железы. Показатель течения заболевания и эффективности терапии карциномы молочной железы. В норме уровень СА 15-3 составляет 0-22 ЕД/мл. Онкомаркер СА 15-3 эффективен в определении рецидивов. Некоторое повышение маркера также может наблюдаться во время беременности. П овышение уровня СА 15-3 может указывать на к арцинома молочной железы (особенно высокий уровень наблюдается в поздних стадиях и при наличии метастазов), бронхогенная карцинома, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак яичников, эндометрия, матки (поздние стадии развития опухоли).

5. Онкомаркер AFP (Альфа-фетопротеин)

В онкологии — маркер первичного рака печени. АФП сходен по составу с альбумином. У взрослых людей норма АФП обычно находится в пределах 15 нг/мл. Концентрация выше 10 МЕ (международная единица)/мл считается патологической. Исследование уровня альфа-фетопротеина может применяться для раннего выявления гепатоцеллюлярной карциномы в группах риска, то есть у пациентов с циррозом печени, хроническим HBsAg — позитивным гепатитом. Уровень АФП может повышаться при некоторых доброкачественных заболеваниях – циррозе печени, хроническом и остром гепатите, хронической почечной недостаточности. При беременности повышение АФП может быть признаком пороков развития плода. АФП выявляется в плазме крови, амниотической жидкости, желчи, плевральной и асцитической жидкостях.

Процессами метаболизма клеток управляет сложная сеть молекулярных взаимодействий, определяющая уровни экспрессии различных генов. Изучение динамики метаболических процессов, происходящих в клетке, и природы метаболитов является частью исследования структурной организации сетей метаболических потоков и основой выявления принципов их регуляции.

Технологии метаболомики и метабономики, в частности использование аналитических систем ВЭЖХ-МС-ЯМР, позволяют определить интерактивную природу клеточных реакций на химические агенты и опасность развития нежелательных побочных эффектов лекарственной терапии в зависимости от индивидуального гено- и фенотипа.

Метаболомика находит применение при разработке анализов индивидуальной восприимчивости к лекарственным средствам, например, варфарину, при определении уровня проканцерогенов – полиароматических углеводородов

Получены сведения о многих метаболических маркерах, идентифицированных при исследовании мочи и других биологических жидкостей с помощью современных технологий. Например, при изучении в эксперименте токсичности HgCl₂, а также наблюдали значительное повышение содержания янтарной, молочной и уксусной кислот и этанола. Изменение концентрации этанола связывают со снижением активности алкогольдегидрогеназы. Дифференцирующими метаболитами для определения степени токсического эффекта ртути являются валин, таурин, глюкоза и оксид триметиламина (ТМАО). Последний является общим биомаркером почечной токсичности и идентифицируется при действии других нефротоксикантов.

Важно отметить влияние кишечной микрофлоры на метаболические процессы. Кишечные бактерии обладают изменчивой восприимчивостью к лекарствам и токсикантам. Участие кишечной микрофлоры в синтезе метаболитов мочи зависит от их природы. Кишечные бактерии играют большую роль в метаболизме метиламина. Образование триметиламина (ТМА) из холина главным образом происходит с помощью кишечных бактерий, тогда как последующее окисление в ТМАО преимущественно происходит в печени. Образование ТМАО является примером сложных метаболических взаимодействий, которые должны рассматриваться с целью адекватной оценки результатов метаболомических анализов. У пациентов с хронической почечной недостаточностью часто происходит чрезмерно быстрый рост кишечных бактерий. Это способствует пониженному пищевому статусу больных, особенно нуждающихся в постоянном диализе. В организме повышаются уровни диметиламина (ДМА) и его канцерогенного метаболита — нитрозодиметиламина (НДМА). Следовательно, повышенный уровень ДМА и НДМА в моче может служить маркером действия почечного токсиканта. Однако различные почечные токсиканты по-разному влияют на рост кишечных бактерий, поэтому важно знать, как изучаемое соединение реагирует с кишечной флорой. Пока затруднительно ответить на вопрос, каким образом сопоставить уровень ДМА как маркера метаболической активности кишечных бактерий и уровень ДМА, зависящий от поступления холина из пищи и других источников, которые могут служить предшественниками синтеза метиламина.

Еще одним примером служит идентификация пироглутамата (5-оксопролина) как маркера токсического действия высоких доз парацетамола (Nацетил-п-аминофенола). Накопление пироглутамата, несомненно, связано с метаболизмом серосодержащих аминокислот, так как процесс может быть остановлен введением метионина, который опосредованно используется организмом как сульфатный и цистеиновый конъюгат парацетамола. В 1Н ЯМР-спектре мочи были обнаружены резонансные характеристики обоих конъюгатов, а также парацетамола глюкуронида. Таким образом, было показано, что 5-оксопролинурия является следствием недостаточного количества серосодержащих аминокислот и может служить биомаркером других химических агентов, которые снижают содержание серосодержащих аминокислот. Изучались образцы мочи людей, подвергавшихся хроническому производственному отравлению гептилом (ракетное горючее) в течение нескольких месяцев, с помощью системы ВЭЖХ-ЯМР. Результаты экспериментов показали повышение уровня 2-аминоадипата, β-аланина, цитруллина, N-α-ацетилцитруллина и аргининсукцината, что можно считать обнаружением биомаркеров токсического эффекта несимметричного диметилгидразина.

Исследователи отмечают встречающиеся противоречия в информации о биомаркерах (метаболитах токсикантов в моче), полученной за последние 10 лет с помощью новых технологий и ранее — традиционными методами.

Малотоксичные вещества могут вызывать временные нарушения метаболизма без нанесения большого вреда тканям и органам, но чувствительный прибор зафиксирует метаболический профиль, отличающийся от принятой нормы. Поэтому интерпретировать результаты анализа необходимо с учетом наиболее полной информации о пациенте.

Определение концентраций основных метаболитов является целью метаболических анализов, однако не менее важным и вполне информативным может быть изучение того или иного метаболита в условиях конкретного организма in vivo. Такие анализы включают использование прекурсоров, меченных изотопами, и исследование образцов определенных метаболитов, меченных изотопами. Соединения, похожие по структуре, но имеющие разный состав изотопов, называются изотопомерами. Использование стабильного изотопа ¹³С, принимая во внимание его распространенность в природе (всего 1,1%), обеспечивает надежность результатов анализа. Методом ЯМР-спектрометрии можно определить расположение изотопа в изучаемом соединении, так как каждый изотопомер показывает определенный ЯМР-спектр Определение состава изотопомера возможно с помощью как прямой одномерной, так и двумерной ¹³С ЯМР-спектрометрии, чаще применяется вариант 2D ЯМР-методов HSQC.

Для изучения метаболизма дейтерированных субстратов применяют 2D ЯМР. Положительная сторона этого подхода заключается в относительной легкости проведения исследований и низкого распространения дейтерия в природе по сравнению, например, с ¹³С. Метод 2D ЯМР использовали для изучения печеночного метаболизма. Так, при исследовании метаболизма L- и D-[метил-2Н₃]метионина ([метил-D₃] метионина) с помощью 2D ЯМР in vivo можно проследить биотрансформацию того или иного изомера, используя специальную поверхностную спираль, помещенную на печень анестезированных крыс. Например, была обнаружена реакция трансметилирования, приводящая к образованию [метил-D₃]саркозина, что позволило определить активность метионинаденозилтрансферазы и глицин-N-метилтрансферазы.

В течение времени некоторые другие метаболиты также становятся дейтерированными из-за действия ферментов, вовлеченных в процессы метаболизма. Одни из дейтерированных саркозинов окисляются в митохондриях с помощью саркозиндегидрогеназы, в конечном счете превращаясь в дейтерированную воду, однако некоторое количество может экскретироваться. Интересно, что аналогичные исследования, в которых использован прекурсор дейтерированного D-метионина, дали по существу такие же результаты, показывающие быстрое превращение D- в L-изомер. Сравнение метаболизма L- и D-[метил-D3]метионина показало, что результаты могут меняться под воздействием бензоата натрия, ингибитора D-аминооксидазы. Преобразование D-метионина в L-метионин, в котором участвует этот фермент, сопровождается обратным аминированием, которое катализируется ферментом глутаминазой II. Было отмечено уменьшение количества L- метионина при введении бензоатов, что, возможно, связано со снижением уровня глицина, так как последний используется в этом случае для образования гиппурата из бензоата. Снижение уровня глицина уменьшает его активность в реакции образования глицин-N- метилтрансферазы, что опосредованно ведет к уменьшению количества L-метионина. Обнаруженные in vivo с использованием метода поверхностной спирали дейтерированные метаболиты печени были определены и в моче с помощью 2D ЯМР. Применяя указанную выше технологию, можно исследовать эффекты специфических химических веществ в метаболических путях.

Следует еще раз обратить внимание на то, что классический аналитический подход к определению содержания метаболитов в биологических системах с использованием внутренних стандартов и построением калибровочных графиков практически неприменим для полных исследований сложных метаболомов. Автоматический анализ данных при определении метаболических характеристик возможен с помощью специальных опознавательных компьютерных программ, коррелирующих результаты исследований многоаспектного набора данных (например, значения хроматографических времен удерживания, интенсивности масс- и ЯМР-спектров). Масштабы сокращения времени получения массива данных огромны. С помощью метода ВЭЖХ-ЯМР-МС-TоF в течение 20 мин (со скоростью 5 спектров/c) можно создать 6000 характерных МС- и ЯМР-спектров, каждый из которых включает более 50000 точек.

Задача состоит в том, чтобы выделить все реальные масс-спектральные и ЯМР-характеристики для более 1000 потенциальных метаболитов, разделенных хроматографически (т.е. в каждой хроматограмме).

Одним из способов визуализации и анализа данных является создание контурных графиков, на осях которых указаны аналитические сигналы методов. Различия в контурах от образца к образцу отражают изменения в метаболических путях. При этом необходимо иметь информацию о том, какому (острому или хроническому) воздействию токсиканта подвергся обследуемый. В некоторых случаях краткосрочные изменения метаболизма при остром отравлении могут быть противоположны этим же изменениям, наблюдаемым у пациента при длительном воздействии токсиканта.

В клинической диагностике метаболических изменений применение комплекса ВЭЖХ-ЯМРМС позволило определить липопротеины плазмы крови. Методом ЯМР-спектрометрии получили индивидуальную характеристику каждого липопротеина, согласно их разделению на липопротеины высокой плотности, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины очень низкой плоскости, имеющих небольшое различие между собой, заключающиеся в разном диаметре фосфолипидного слоя в оболочках липопротеинов, что позволяет безошибочно диагностировать и прогнозировать течение коронарных заболеваний. Результаты этих исследований были полезны при определении механизма повреждающего действия токсикантов, оказывающих влияние на метаболизм липопротеинов, мобилизацию гликогена, стадии глюкогенеза и другие процессы, происходящие в организме в режиме реального времени. Несмотря на многие вопросы, еще требующие ответа исследователей, и несовершенство аналитических технологий, метабономический анализ произвел революционный прорыв в токсикологии и фармакологии.

Дата добавления: 2017-01-13