Денатурация белков

Лабораторная работа №6

Цветные реакции на белки

Лабораторная работа № 5

Цель работы: изучение химических свойств аминокислот и белков.

Реактивы и оборудование:

1) гликокол – 0,2н,

2) метилрот – 0,2%,

3) CuO – порошок,

4) 2н раствор NaOH,

5) раствор белка,

6) 2н раствор HNO₃,

7) 2н раствор NH₄OH,

8) раствор Pb(CH₃COO)₂,

9) раствор формалина 40%,

10) тонкие стеклянные капилляры,

11) пробирки и спиртовки.

Опыт 5.1 Цветные реакции на белки

а) Биуретовая реакция.

К 1 -2 мл раствора белка добавить равный объем щелочи и затем 3-4 капли медного купороса. Как изменится окраска раствора?

б) Ксантопротеиновая реакция.

К 1 мл раствора белка прибавить 0,2-0,3 мл азотной кислоты. Затем нагреть до кипения и кипятить 1-2 минуты. При добавлении нескольких капель аммиака как изменится окраска раствора?

С помощью этой реакции обнаруживают наличие в белке ароматических ядер, т.е. остатков таких аминокислот, как фенилаланин, тирозин и триптофан.

Изложить ваши наблюдения и написать структурные формулы:

а) фенилаланина, тирозина и триптофана, б) образование дипептида из аланина.

Опыт 5.2 Реакция на обнаружение серосодержащих аминокислот

(цистин, цистеин)

Налить в пробирку 3 капли раствора уксуснокислого свинца и 1-2 капли едкого натра до растворения образовавшегося осадка гидроокиси свинца.

Прибавить 3-4 капли белка исмесь осторожно нагреть. Раствор начинает темнеть (выделяется осадок сернистого свинца).

При необратимом осаждении белков нарушается их вторичная, третичная и четвертичная структуры, белки денатурируют и утрачивают свои биологические и физико-химические свойства.

Денатурация белков может быть вызвана рядом физических и химических факторов: повышением температуры, взаимодействием с солями тяжелых металлов, концентрированными минеральными кислотами, продолжительным воздействием органических растворителей и другими.

Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев наблюдается ренатурация – восстановление исходной конформации молекулы белка и его природных свойств.

Опыт 5.3 Осаждение белков органическими растворителями

Добавление смешивающих с водой нейтральных органических растворителей, например этанола, ацетона, хлороформа, уменьшает растворимость большинства белков в воде и вызывает выпадение их в осадок. Органические растворители снижают диэлектрическую постоянную белковых растворов, вследствие чего усиливается притяжение между белковыми частицами, способствующее агрегации белков и снижению их растворимости. Кроме того органические растворители нарушают гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы.

Кратковременное воздействие на белки органическими растворителями при низких температурах вызывает их обратимое осаждение. Однако длительное воздействие высоких концентраций органических растворителей при относительно высоких температурах (+20° и выше) приводит к денатурации белков, необратимому осаждению.

Ход работы

1. К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5-2 мл 96%-ного этилового спирта и встряхивают пробирку. Выпадает белый осадок белка.

2. К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5-2,0 мл 80%-ного ацетона и встряхивают пробирку. Выпадает осадок белка.

Опыт 5.4 Денатурация белков при нагревании

Белки подвергаются денатурации и выпадают в осадок при нагревании их растворов до температуры выше 50-60°С. Свернувшиеся белки не могут быть снова переведены в раствор, так как при нагревании нарушаются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и вторичную структуры белковых молекул, изменяются их физико-химические свойства, в том числе уменьшается их способность к гидратации.

В изоионном состоянии при нагревании увеличивается степень денатурации белков. Так как изоионная точка для большинства белков находится в слабокислой среде, то небольшое подкисление раствора белка способствует более полной его коагуляции при нагревании.

Ход работы

В две пробирки вносят по 1 мл раствора яичного альбумина. В одну из пробирок добавляют 1 каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты. Обе пробирки нагревают. В пробирке где раствор подкислен, свертывание белка происходит быстрее. Объясните результаты наблюдения и разницу в появлении осадков.

Опыт 5.5 Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Концентрированные минеральные кислоты (H₂SO₄, HCl, HNO₃ и др.) вызывают необратимое денатурационное изменение белков, следствием чего является агрегация белковых молекул и их осаждение.

Денатурирующее действие минеральных кислот может быть объяснено их воздействием на функциональные группы белка. Минеральные кислоты, например, превращают отрицательную группу –СОО^- в недиссоциированную группу –СООН, что приводит к нарушению ионных связей /солевых мостиков/ и, как следствие, к разворачиванию полипептидных цепей.

При длительном воздействии концентрированными минеральными кислотами могут произойти гидролиз белка (разрыв пептидных связей), а также реакции нитрования, окисления, сульфирования, конденсации и др.

Ход работы

1. К 1 мл концентрированной серной кислоты осторожно, под тягой, по стенке пробирки добавляют 1 мл раствора яичного альбумина так, чтобы не смешивать жидкости.

На границе соприкосновения двух жидкостей образуется белое кольцо выпавшего в осадок белка. При осторожном смешивании жидкостей осадок не исчезает.

2. В двух других пробирках проводят такие же опыты, но с концентрированными соляной и азотной кислотами.

Опыт 5.6 Осаждение белков органическими кислотами

Белки из растворов необратимо осаждают органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота ССl₃СООН и сульфосалициловая кислота С₆Н₃(ОН)(СООН)SO₃H являются очень чувствительными, специфическими реактивами на белок и широко применяется с этой целью.

Осаждение белков трихлоруксусной кислотой часто применяют для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови), продукты их распада при этом остаются в растворе.

Ход работы

1. В пробирку вносят 1 мл раствора белка и добавляют несколько капель 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

2. В другую пробирку вносят 1-2 мл раствора белка и добавляют несколько капель сульфосалициловой кислоты. Наблюдают выпадение белка в осадок.

Опыт 5.7 Осаждение белков солями тяжелых металлов

При действии небольших концентраций солей тяжелых металлов (Сu⁺², Pb⁺², As⁺³, Hg⁺²,Bi⁺³) на растворы белка происходит денатурация белковых молекул. Осаждение денатурированного белка обусловлено адсорбцией иона тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимых в воде комплексных соединений. Кроме того, тяжелые металлы снимают электрический заряд и глубоко изменяют вторичную и третичную структуру макромолекул белка, образуют связи между функциональными группами молекул.

Существуют определенные границы концентраций солей тяжелых металлов, при которых комплекс белка с солью тяжелого металла переходит в осадок, либо находится в растворимом состоянии.

Ход работы

1. К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 1%-ного раствора сульфата меди. Выпадает осадок, который растворяется в избытке (7-10 мл) раствора этой соли.

2. К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 0,5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Выпадает осадок, который растворяется также в избытке раствора этой соли.

е) осаждение белков специфическими реактивами

Необратимое осаждение белков можно вызвать воздействием на их растворы различными специфическими реактивами: танином, пикриновой кислотой, гексацианоферратом (II) калия и др.

Механизм осаждения белков этими реактивами заключается в образовании нерастворимых комплексных соединений с аминными группами белков.

Ход работы

1. Осаждение белков танином

В пробирку вносят 1 мл раствора яичного альбумина, добавляют несколько капель 1%-ной уксусной кислоты и 1 мл насыщенного раствора танина. Выпадает осадок желтовато-серого цвета.

2. Осаждение белков пикриновой кислотой

К 1 мл раствора яичного альбумина, подкисленного уксусной кислотой, добавляют несколько капель насыщенного раствора пикриновой кислоты. Образуется желтоватый осадок белка.

3. Осаждение белков гексацианоферратом (ΙΙ) калия

К 1 мл раствора яичного альбумина, подкисленного уксусной кислотой, по каплям добавляют 5%-ный раствор гексацианоферратом (ΙΙ) калия. Выпадает осадок белка.

Дата добавления: 2017-02-01