Визначення нуклеотидної послідовності ДНК

Секвенування − визначення нуклеотидної послідовності. Методи, що надали можливість ідентифікувати генетично важливі ділянки ДНК, мають велике значення. До основних методів секвенування належать хімічний і ферментативний.

Хімічне секвенування засновано на вибірковій хімічній деградації нуклеотидів. Метод розроблений у 1976 році А. Максамом і В. Гілбертом. Для цього методу необхідно отримати одноланцюгову молекулу ДНК, на одному з кінців якої роблять радіоактивну позначку за допомогою ізотопа фосфору ³²Р, препарат позначеної ДНК поділяють на чотири порції і кожну обробляють реагентом, який специфічно руйнує одну або дві з чотирьох основ. Необхіднопідібрати умови реакції таким чином, щоб на одну молекулу було лише декілька пошкоджень. За обробки піперидином в ДНК утворюється розрив у тому місці, де була зруйнована основа.

Рис. 15. Картирування сайтів рестрикції:

а - результати гель-електрофореза фрагментів ДНК;

б - рестрикційна карта,що побудована на підставі даних гель-електрофорезу

В результаті створюється набір позначених фрагментів, довжина яких визначається відстанню від зруйнованої основи до кінця молекули. Фрагменти, що створилися вусіх чотирьох реакціях, піддають електрофорезу на чотирьох доріжках в акриламідному гелі, потім роблять радіографію, і фрагменти, що містять радіоактивну позначку, залишають «відбитки» на рентгенівській плівці. За їх положенням можна визначити, на якій відстані від позначеного кінця була зруйнована основа. Таким чином, на підставі набору смуг на рентгенівській плівці визначають нуклеотидну послідовність фрагменту, що аналізується (рис. 16).

Дата добавления: 2017-02-01