Методи конструювання рекомбінантних ДНК

Рекомбінантні – це ДНК, що створені поєднанням invitro (у пробірці) двох, або більш фрагментів ДНК, отриманих з різних біологічних джерел.

Певні фрагменти ДНК, у тому числі й фрагменти, що містять гени, отримують з використанням ферментів рестрикції. Рестриктази можуть створювати фрагменти як з «тупими», так і з «липкими» кінцями. Методи з'єднання фрагментів залежать від того, які кінці у фрагментів ДНК, що поєднуються.

З'єднання за однойменних «липких» кінців. Деякі рестриктази, наприклад, EcoR1, розрізують дволанцюгову ДНК таким чином, що протилежні ланцюги розміщуються зі зсувом один від одного на рівній відстані від центру сайта розпізнавання. Ці комплементарні одна до одної ділянки мають тенденцію до асоціації за рахунокпарування основ.

Парування основ здійснюється лише між комплементарними послідовностями, тому ААТТ-кінці, що створені EcoR1, не будуть поєднуватися із AGCT-кінцями, що створені HindIII. Але будь-які два фрагменти (незалежно від походження), що створилися під дією однієї тієї ж самої рестриктази, можуть об'єднатися за рахунок утворення водневих зв'язків між одноланцюговими ділянками комплементарних нуклеотидів (рис. 19).

Однак, після такого з'єднання цілісність подвійної спіралі не відновлюється, оскільки залишається два розриви у фосфодіефірному остові. Для їх відновлення, тобто скріплювання, або лігирування ланцюгів використовують фермент ДНК-лігазу. Цей фермент у живій клітині виконує таку саму функцію - скріплювання фрагментів ДНК, що синтезуються за реплікації. Таким чином, ДНК-лігаза завершує утворення рекомбінантної ДНК. Вперше такі експерименти були здійснені у 1972 р. (П. Берг, США), і було показано, що використання рестриктази, яка створює «липкі» кінці, у поєднання із ДНК-лігізою може бути основою для створення загального методу рекомбінації.

Рис. 19. З'єднання фрагментів за однойменних «липких» кінцях

З'єднання фрагментів з «тупими» кінцями. У цьому разі реакція лігирування (скріплювання) має власні особливості. ДНК-лігаза, що кодується фагом Т4, здатна з'єднувати дволанцюгові фрагменти, але для ефективного перебігу реакції необхідна наявність високої концентрації фрагментів ДНК з «тупими» кінцями і майже в 10 разів більшої концентрації ферменту. Однак, і в цьому разі ефективність цієї реакції на порядок нижча за ефективність скріплювання по «липких» кінцях.

З'єднання фрагментів з р ізнойменними кінцями. «Липкі» кінці можна ферментативним шляхом з'єднати з молекулою ДНК з «тупими» кінцями. Для цього «затуплюють» «липкі» кінці. Це досягається або відщепленням нуклеотидів «липких» кінців за допомогою фермента нуклеази S1, яка руйнує лише одноланцюгову ДНК, або «липкі» кінці добудовують, тобто за допомогою ДНК-полімерази на підставі одноланцюгового «липкого» кінця синтезують комплементарний до нього ланцюг, а потім проводять скріплення фрагментів за допомогою ДНК-лігази.

Коннекторний метод з'єднання фрагментів ДНК. Сутьметоду полягає у приєднанні до кінців одного з фрагментів ДНКодноланцюгового полінуклеотиду, наприклад, полі-А (dA), а доіншого − комплементарного до нього, наприклад, полі-Т (dT)(рис. 20). Процес приєднання ділянок полі-А і полі-Т здійснюється задопомогою ферменту − кінцевої трансферази. Фрагменти, щодобудовані таким чином, потім змішують і обробляють ДНК-лігазою.При цьому між фрагментами вбудовуються ділянки Такі

додаткові послідовності можуть впливати на функції молекул, що з'єднуються, тому завжди, якщо можливо, для отримання рекомбінантних молекул ДНК використовують «липкі» кінці, створені внаслідок дії рестриктаз.

Лінкерний метод з'єднання фрагментів ДНК. У разі, коли необхідно скріпити фрагменти, що створені різними рестриктазами, які мають різні, тобто не комплементарні один до одного кінці, використовують так звані лінкери (або перехідники). Лінкери. − хімічно синтезовані олігонуклеотиди, що являють собою сайти рестрикції або їх комбінацію. Існує велика кількість таких генних перехідників. Зрозуміло, що за використання лінкерів потрібно враховувати необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто всередину лінкера розташовують будь-якийрегуляторний генетичний елемент, наприклад, промотор або ділянку пов'язану із рибосомою. В цьому випадку лінкери не лише забезпечують поєднання генів, але й обумовлюють їх експресію. Є лінкери «тупий кінець − липкий кінець».

Лінкерний метод був запропонований Р. Шеллером і його співробітниками у 1977 р. Метод дозволяє досить просто рекомбінувати invitro практично кожні фрагменти ДНК.

Рис. 20. Коннекторний метод з'єднання фрагментів ДНК

Розроблений підхід передбачає такі операції (рис. 21):

− по тупих або липких кінцях фрагменту ДНК, який необхідно рекомбінувати, за допомогою лігази фага Т4 приєднують короткі синтетичні дволанцюгові сегменти, що містять сайти розпізнавання для певної рестриктази;

− отриманий фрагмент обробляють зворотною рестриктазою, внаслідок чого створюються липкі кінці;

− отриманий фрагмент рекомбінують invitro з іншими молекулами ДНК звичайним методом.

Використання лінкерів робить цей метод рекомбінації фрагментів ДНК invitro універсальним, оскільки початкові фрагменти можна отримувати різними способами.

Рис. 21. Лінкерний метод з'єднання фрагментів ДНК

Лінкерний метод порівняно із коннекторним більше використовується у генно-інженерних модифікаціях, оскільки він простіший і, крім того, дає можливість легко вилучати вбудований фрагмент із гібридної молекули ДНК, що буває важливим при перенесенні фрагмента в інше генетичне оточення.

Дата добавления: 2017-02-01