Введення молекул ДНК у клітини

Необхідний етап генно-інженерного експерименту − введення отриманих invitro гібридних молекул ДНК у клітини, що забезпечують реплікацію цих молекул, з метою розмноження, селекції і виділення клонів гібридів.

Процес, внаслідок якого чужорідна ДНК проникає у клітину-реципієнт і викликає у ній зміни, що успадковуються, має назву трансформація. Трансформацію клітин можуть здійснювати як молекули ДНК, що реплікуються у клітинах позахромосомно (плазміди), так і молекули ДНК, що інтегруються у геном клітини (лінійні та кільцеві молекули ДНК). Генетично трансформовані клітини називаються трансформантами.

Інколи, в процесі розмноження фагів у бактеріях створюються часточки, що поряд з фаговою ДНК або замість неї містять фрагменти бактеріальної ДНК. Такі часточки мають назву трансдукуючі. За своїми властивостями вони не відрізняються від звичайних фагових віріонів (фагові часточки, складаються з ДНК, або РНК, і білка), але під час зараження ними нових клітин вони передають їм генетичні детермінанти попередніх господарів. Таким чином відбувається процес трансдукції, тобто трансдукція − це перенесення генетичної інформації від клітини-донора до клітини-реципієнта за допомогою фага.

Однак, немає потреби очікувати коли ДНК фага буде захоплювати фрагмент чужорідної ДНК для її внесення в клітину-реципієнт, якщо можливо штучно створити рекомбінантну ДНК фага і використовувати такий фаг як вектор (наприклад, для клонування великих фрагментів ДНК). Тим.більше, що фаговий вектор вводить рекомбінантну ДНК за зараження клітини, тобто методом інфекції, що значно ефективніше, ніж шляхом трансформації або трансдукції. Введення у клітину нуклеїнової кислоти віруса з наступним утворенням вірусних нащадків, називається трансфекцією. Вірусні клони, що отримані після трансфекції, мають назву трансфектанти.

Поряд з хромосомною ДНК в бактеріальній клітині може існувати і додатковий генетичний матеріал у вигляді плазмідної ДНК. Плазміди є репликонами і стабільно успадковуються. Як правило, плазміди мають форму кільця, побудованого з двох ланцюгів ДНК.

У клітині може міститися від 10 до 200 копій дрібних плазмід, або 1...4 копії великих. Реплікація плазмід значною мірою залежить від клітини-власника. Мутації, що порушують реплікацію бактерії, як правило, впливають і на реплікацію плазмід. Ряд плазмід, що містяться у клітинах у незначній кількості − 1...2 копії, мають власну систему реплікації.

Плазміди часто змінюють фенотипові властивості клітин. Це пов'язано з тим, що вони містять детермінанти стійкості до антибіотиків −R-плазміди, до йонів важких металів або гени біодеградації деяких органічних сполук - D-плазміди. Виявлено також плазміди, які мали генетичні системи, що детермінують перенесення плазмід в інші клітини внаслідок кон'югації. Таким чином, кон'югація − це процес генетичного обміну за якого здійснюється перенесення генетичної інформації від клітини-донора до клітини-реципієнта за безпосереднім контактом клітин між собою. За здатністю до кон'югативного перенесення плазміди поділяються на кон'югативні і некон'югативні. Кон'югативні плазміди містять так званий фактор фертильності F. Клітини, що містять цей фактор, почали називати клітинами F⁺, а клітини, які не містять цього фактора − клітинами F⁻. Виявилося, що клітини з фактором F завжди є донорами генетичного матеріалу, а клітини, в яких цей фактор відсутній − реципієнти.

З клітини-донора в клітину-реципієнт переноситься лише одна нитка плазмідної ДНК, починаючи зі специфічного сайту оrіТ, де створюється одноланцюговий розрив. У наступному відбувається розподілення ланцюгів ДНК, яке необхідне для ініціації перенесення і комплементарного синтезу ДНК як у клітині-донора, так і у клітину-реципієнта. Етап, що завершує цей процес, пов'язаний з утворенням кільцевих структур плазмідних ДНК.

F-плазміди, також, сприяють перенесенню в клітини-реципієнти інших, некон'югативних плазмід, цей процес має назву − мобілізація. Таким чином, перенесення некон'югативних плазмід за рахунок кон'югативних − це процес мобілізації. Мобілізація може здійснюватися двома шляхами:

1. По-перше, перенесення некон'югативної плазміди може відбуватися за рахунок специфічних речовин, що синтезуються генами кон'югативної плазміди, які за це відповідають. Ці речовини активують специфічні ділянки генів некон'югативної плазміди, які, в свою чергу, створюють умови, за яких відбувається перенесення плазміди в клітину-реципієн.

2.По-друге, некон'югативні плазміди можуть переноситися в клітини-реципієнти поряд з кон'югативними плазмідами у складі коінтегратів. Тобто, коінтеграти − це єдина молекула ДНК, в якій поєднано два або більше реплікони (плазміди) і кожен з них здатний до незалежної реплікації. У природі частіше трапляються коінтеграти між плазмідами-RTF, тобто плазмідами, що детермінують стійкість до тетрацикліну і здатність до кон'югативного переносення, з плазмідами, які містять гени стійкості до декількох антибіотиків, плазмідами-r. Поєднання цих плазмід і створення комбінації −RTF-r сприяє швидкому розповсюдженню цього коінтеграту в бактеріальному середовищі.

Необхідно зазначити, також, що плазміди-F можуть входити і в бактеріальну хромосому за типом незаконної рекомбінації, тобто на підставі обміну негомологічними ділянками ДНК. Хромосоми бактерії, до яких включено фактор фертильності F, набувають здатність до перенесення в клітини придатного реципієнту. Ця властивість використовується для створення рекомбінантних бактерій.

Клітини не завжди здатні до трансформації. Трансформуються лише компетентні клітини, що здатні адсорбувати і поглинати ДНК. У багатьох бактерій компетентність виникає лише на певному етапі росту культури — в стадії компетентності.

Один з найважливіших етапів генетичної трансформації − це перенесення молекул ДНК через оболонку клітини. На стан компетентності клітин впливають різні фактори зовнішньогосередовища. До них належать температура, рН, йони важких металів, осмотичний тиск та ін.

Компетентні клітини відрізняються від некомпетентних зміною властивостей клітинної оболонки В них знижено поверхневий заряд, підвищено чутливість до осмотичного шоку. Мікроорганізми, в яких відсутня природна компетентність, також можуть бути трансформовані. Для цього клітини обробляють тим чи іншим способом для ініціації в них здатності до поглинання ДНК. Найбільш поширений метод індукції компетентності у клітин Е. соli − це обробка крижаним розчином СаС1₂. Використовують також спосіб глибокого заморожування з наступним відтаюванням клітин, що забезпечує збільшення проникненості для фагової, плазмідної і хромосомної ДНК. Метод має назву кріотрансформація. Для підвищення проникненості клітинних мембран на них діють електричним струмом. Ця процедура називається електропорація. Умови її проведення різні для різних видів бактерій. За роботи з Е. соli клітинну суспензію і ДНК розміщують у посудині з зануреними електродами і подають одиничний імпульс струму. Після цього ефективність трансформації збільшується до 10⁹ для коротких плазмід (приблизно 3 т.п.н.) і до 10⁹ для великих (приблизно 135 т.п.н.).

Дата добавления: 2017-02-01