Використання транспозонів для клонування ДНК.

Транспозони, повсюдно поширені в живій природі, є мобільними генетичними елементами, що мають здатність переміщатися з однієї частини генома в іншу шляхом вирізання й наступної інтеграції за механізмом, незалежним від гомологічної рекомбінації. Окремі представники цієї великої родини мобільних генетичних елементів бактерій дуже розрізняються за своєю структурою й механізмами внутрішньогеномного переміщення. Відомо вже, принаймні, чотири механізми транспозиції. За консервативної транспозиції транспозон вирізується з реплікона-донора й у незмінному вигляді інтегрується в реплікон-реципієнт. Пролом, що створюється у вихідному репліконі, відновлюється внаслідок репарації. Реплікативна транспозиція характеризується тим, що транспозон не вирізається з локуса, в якому він розташований. Замість цього реплікон-донор і реплікон-реципієнт створюють коінтеграт (об'єднуються один з одним), у процесі формування якого виникає друга копія транспозону. Внаслідок наступного за цим поділу репліконів, кожний з них стає власником копії вихідного транспозону. Процес поділу коінтеграта здійснюється за допомогою гомологічної рекомбінації або за участю сайт-специфічної рекомбіцази (резольвази), що кодується транспозоном і розпізнає специфічні послідовності (res). У процесі ексцизійної транспозиції сайт-специфічна ендонуклеаза (інтеграза) за участю інших білкових факторів вирізає транспозон з реплікона-донора, відновлюючи кільцеву структуру реплікона. При цьому одночасно утворюється кільцевий ковалентно замкнений мобільний елемент як проміжна сполука, що вбудовується в реплікон-реципієнт. Нарешті, у процесі ретротранспозицїі має місце транскрипція ретротранспозона з утворенням РНК, що за участю матурази віддаляється з вихідної РНК та інтегрується в безінтронну РНК, не обов'язково того ж виду, що й РНК-донор (зворотний сплайсинг). Далі РНК-реципієнт за допомогою зворотної транскрипції перетворюється в кДНК й інтегрується в реплікон-реципієнт за механізмом RecA-залежної гомологічної рекомбінації. Альтернативно, зрідка, транскрипт ретротранспозона, що містить інтрон, може за допомогою зворотного сплайсинга вбудовуватися в один із ланцюгів розплетеної дволанцюгової ДНК-реципієнта. Після внесення в другий ланцюг ДНК одноланцюгового розриву за допомогою ендонуклеази, 3'-кінець ДНК, що створився, стає місцем ініціації зворотної транскрипції на матриці інтегрованої РНК, що приводить, в остаточному підсумку, до утворення дволанцюгової ДНК із вставкою послідовності ретротранспозона. Всіма трьома видами активності: зворотної транскриптази, матурази й ендонуклеази володіє білок, що кодується геном іер (intronencodedprotein), локалізований в інтроні ретротранспозона.

За вибором місць інтеграції в реплікон-реципієнт транспозони поділяють на три групи. Деякі з них, наприклад, Тп5 і бактеріофаг Ми, інтегрують у геном випадковим чином, інші вбудовуються в обмежене число ділянок ДНК, для третіх характерна сайт-специфічна інтеграція. Саме здатність ряду транспозонів вбудовуватися випадково у геном клітини-власника часто використовується сучасною молекулярною генетикою для клонування невідомих послідовностей і картирування генома.

Вбудовування транспозону в результаті транспозиції в частину гена, що кодує, як правило, його інактивує, що супроводжується розвитком відповідного фенотипу. Фрагмент ДНК із транспозоном може бути виділений із клонотеки послідовностей за допомогою зондів, для створення яких використовуються послідовності транспозони. Оскільки послідовності транспозонів, що використовуються у такій роботі, відомі, не виникає ускладнень за допомогою відповідних рестриктаз виділити транспозон разом із фланкуючими його невідомими послідовностями нуклеотидів. За допомогою набору рестриктаз можна побудувати детальну фізичну карту невідомих послідовностей, що прилягають до інтегрованого транспозону, і здійснити подальше пересування у напрямку невідомих послідовностей в обидва боки від транспозону.

Дата добавления: 2017-02-01