Приклади секвенування повних геномів різних типів організмів

Організми	Розмір генома, млн. п.н.	Передбачена кількість генів	Рік завершення секвенування
Бактерія (Haemophilus influenzae)	1,8
Дріжджі (Saccharomycescerevisiae)	12,1
Кільчастий хробак (Caenorhabditis elegans)	97,0
Рослина (Arabidopsis thaliana)	100,0
Комаха (Drosophila melanogaster)	180,0
Людина (Homo sapiens)	3000,0	35000…45000

Полімеразна ланцюгова реакція. Чисельні (ампліфіковані у мільйон разів) копії певних фрагментів ДНК отримують invitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яку поширено використовують у наш час. Вперш її запропонували у 1985 році Р.К. Сейки, С. Шарф, Ф. Фалуна, К.Б. Мулліс, Г.Е. Хорн, Х.А. Ерліх і Н. Арнхейм.ПЛР високо специфічна і чутлива, за її допомогою можна виявити, розмножити і дослідити навіть одиничну копію гена у вихідному матеріалі. Зазвичай 30 циклів ампліфікації протікає протягом трьох годин.

Для здійснення ПЛР необхідно:

− два синтетичних олігонуклеотидних праймери (короткі олігонуклеотиди, що гібридизуються із матрицею і є запалом за її копіювання), завдовжки близько 20 нуклеотидів, комплементарні ділянкам ДНК з протилежних ланцюгів, що фланкирують (оточують) послідовність-мішень, яку розмножують; їх 3'-гідроксильні кінці після отжигу (процес утворення дволанцюгових молекул (ДНК-ДНК або ДНК-РНК) з одноланцюгових полінуклеотидних комплементарних ланцюгів) з ДНК повинні бути орієнтовані назустріч один одному;

− ДНК-мішень завдовжки від 100 до ~ 35000 п.н.;

термостабільна ДНК-полімераза, що не втрачає активності за температури 95°С і вищої;

− чотири дезоксирибонуклеотиди.

Типова ПЛР-ампліфікація складається з багаторазового повторення таких реакцій.

1.Денатурація. Перший етап ПЛР полягає в тепловій денатурації зразка ДНК витримуванням його за температури 95°С протягом, що найменше 1 хв. Крім ДНК, в реакційній суміші міститься надлишок двох* праймерів, термостабільна ДНК-полімераза Taq, що виділена з бактерій Thermusaquaticus, і чотири дезоксирибонуклеотида.

2.Ренатурація. Температуру суміші повільно знижують, приблизно до 55°С, при цьому праймери спаровуються із комплементарними послідовностями ДНК.

3.Синтез. Температуру підвищують приблизно до 75°С – величини, оптимальної для ДНК-полімерази Taq. Починається синтез комплементарного ланцюгу ДНК, що ініціюється 3'-гідроксильною групою праймера (рис. 18).

Рис. 18. Схема полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР):

а - ДНК-мішень, б - праймер у ПЛР, в - нова ДНК, г - напрямок ампліфікації, де - денатурація і синтез

У першому циклі після денатурації ДНК і зв'язування з неюпраймерів ДНК-полімераза створює дволанцюгові структури, в яких батьківські ланцюги ДНК поєднані із знов синтезованими комплементарними ланцюгами різної довжини, але із фіксованим 5'-закінченям. Уже у другому циклі створюються два ланцюги специфічної послідовності, що мають задані розміри. У третьому циклі ці ланцюги дають начало дволанцюговим детермінованим за розміром фрагментам ДНК. У кожному наступному циклі їх кількість подвоюється і теоретично досягає за 22 цикли, а на практиці – за ЗО циклів більше мільйона копій. Вихідні молекули ДНК і структури, що створилися у першому циклі, присутні в реакційній суміші наприкінці ПЛР у незначній кількості.

Для здійснення ПЛР необхідно знати послідовність як найменш 17 п.н. з обох боків дослідного фрагменту ДНК. Зазвичай синтезують два дезоксинуклеотиди довжиною 20...30 основ, які являють собою кінцеві послідовності фрагменту ДНК, що нас цікавить. Використовуючи комплементарні до цих ділянок олігомери -праймери, запускають ампліфікацію (процес збільшення копій гену). Надлишкову кількість праймерів змішують з геномної ДНК, а потім послідовно здійснюють реакції денатурації, випалу (ренатурації) і нарощування ланцюга (подовження праймера). Теплова денатурація супроводжується розплітанням подвійної спіралі ДНК. За зниження температури має місце випал олігонуклеотидів, тобто здійснюється гібридизація олігонуклеотидних праймерів із своїми комплементарними послідовностями. Ріст ланцюга праймерів каталізує ДНК-полімерза в присутності дезоксирибонуклеозид-трифосфатів, і в результаті добудовується новий комплементарний ланцюг ДНК.

За повторних циклів теплової денатурації, випалу і синтезу нові ланцюги ДНК, що утворилися, є шаблонами (матрицями) для праймерів, що викликає експоненціальне нарощування ділянки ДНК, обмеженої праймерами, що входять до складу цих фрагментів.

У разі ампліфікації геномної ДНК з клітин (тканин) хребетних тварин інколи відбувається накопичення фрагментів нез'ясованого походження. Тоді здійснюють серію додаткових ампліфікацій, використовуючи інший набір олігонуклеотидних праймерів.

На перших етапах використовували в ПЛР так звані фрагменти Кленова ДНК-полімерази І Е. соli, які виявилися термолабільними, і після кожного циклу денатурації необхідно було додавати нову Порцію ферменту. Крім того, за пониженої температури випалузнижувалася специфічність ампліфікації.

Після виділення термостабільних ДНК-полімераз, зокрема, з бактерій Thermusaquaticus (Taq-полімераза) суттєво збільшилася ефективність ПЛР. Taq -полімераза зберігає активність після теплової денатурації ДНК і не виникає необхідності замінювати фермент після кожного циклу. Температурний оптимум реакції становить 70...75°С, що значно підвищує специфічність, кількісний вихід і можливу довжину копій фрагментів ДНК, що амплифікуються.

Успіх певної ПЛР суттєво залежить від правильного вибору праймерів. Для мінімізації можливості неправильного спарування, праймер повинен відповідати деяким вимогам. Його довжина має бути 17...30 нуклеотидів за вмісту GC-napблизько 50%. Чим менший вмістGC-nap у праймері, тім більшою повинна бути його довжина. Необхідно запобігти появі вторинних структур у праймері і більше трьох-чотирьох однакових нуклеотидів підряд. Праймери, що використовуються в одній реакції, не повинні мати комплементарні ділянки.

Область використання ПЛР велика і постійно розширюється: діагностика генетичних захворювань; виявлення генетичного матеріалу патогенних мікроорганізмів у клінічних зразках; синтез зондів для гібридизації; створення бібліотек кДНК (копійних ДНК) з малої кількості мРНК; мультиплікація ДНК з метою секвенування; спрямований мутагенез таін.

Дата добавления: 2017-02-01