Ланцюга ДНК, що аналізується

Нуклеотидна послідовність

Рис. 16 . Схема методу секвенування за Максамом-Гілбертом

За допомогою цього методу вдалося встановити багато послідовностей різноманітних ДНК, але він має ряд недоліків, що пов'язані з тривалістю і трудомісткістю процедур.

У наш час найбільш широко використовується метод ферментативного секвенування або метод секвенування шляхом термінації (зупинки синтезу) ланцюга, запропонований Ф. Сенгером у 1977р. В основі методу Сенгера лежить принцип реплікації комплементарного ланцюга ДНК на одноланцюговій матриці, при тому що під час реплікації відбувається термінація − припинення синтезу дочірнього ланцюга у різних місцях, а наступний ланцюг знову починає синтезуватися від початку матриці до наступної термінації. Основним моментом ферментативного секвенування є термінація синтезу ланцюга, що будується. Агентами термінації, які викликають зупинку реплікації, є дідезоксинуклеотиди (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ) − це нуклеотиди позбавлені 2'- і 3'-гидроксильних груп при вуглеводних атомах цукрового кільця і тому подовження ланцюга, що відбувається за рахунок приєднання чергового нуклеозидтрифосфату до гідроксильної групи, припиняється.

Оскільки метод секвенування заснований на процесі реплікації ДНК, то основним ферментом є ДНК-полімераза. За наявності одноланцюгової ДНК-матриці, короткого полінуклеотидного праймера і нуклеотидів за принципом компліментарності відбувається синтез іншого ланцюга ДНК. При цьому подовження ланцюга здійснюється до того часу, коли замість дезоксинуклеотиду не приєднається дидезоксинуклеотид. Приєднання останнього викликає зупинку синтезу (рис. 17).

У пробірках збирають чотири реакційні суміші, що мають однаковий склад: фрагмент ДНК-матриці, в якій визначають нуклеотидну послідовність, чотири дезоксинуклеотиди достатньої кількості для здійснення росту комплементарного ланцюга, радіоактивно позначений короткий праймер, комплементарний фрагменту ДНК-матриці, з якого ДНК-полімераза подовжує синтез. У кожну пробірку потім додають лише один з дидезоксинуклеотидів. У всіх пробірках буде відбуватися термінація ланцюга, що синтезується, лише в тому місці, де ДНК-полімераза приєднуватиме дідезоксинуклеотид, який був доданий у реакційну суміш, тобто в одній пробірці синтез припиняється за приєднання до комплементарного ланцюга ддАТФ, в іншій − ддГТФ і т.д. Оскількиобрив ланцюга відбувається у випадкових місцях, то створюється набір фрагментів усіх можливих довжин, починаючих з праймера до кінця фрагменту, що досліджується.

Рис. 17. Схема методу секвенування за Сенгером:

а - припинення росту ланцюга ДНК; б - радіоавтографія гелю

Фрагменти ДНК, що були отримані, розподіляють у поліакриламідному гелі (з точністю до одного нуклеотиду), проводять радіографію і на підставі побаченого розподілу фрагментів у чотирьох пробірках установлюють нуклеотидну послідовність.

Використання флуоресцентних барвників, пов'язаних з нуклеотидами термінації, дозволяє проводити усі реакції в одній пробірці. Крім того, розроблено принципово нові підходи до секвенування, наприклад, секвенування шляхом гібридизації з фіксованими олігонуклеотидними чипами, секвенування з використанням екзонуклеаз та інші. Усі ці методи дозволяють досить швидко вирішувати проблеми секвенування як великих ділянок ДЇЖ, так і будь-яких геномів. Отримані результати вносять у бази даних – банки генів.

Необхідність отримання інформації про послідовність нуклеотидів ДНК усе зростаючих масштабів викликала потребу щодо розгляду питання про автоматизацію процесу секвенування ДНК, оскільки існуючі ручні методи вже не дозволяли справляться з такими великими обсягами роботи.

Автоматичне секвенування – це, в першу чергу, електрофоретичне розподілення позначених продуктів реакції абл.ичи за допомогою спеціальних приладів – автоматичних секвенаторів ДНК. Автоматизації за допомогою біороботів підлягає також процес напрацювання матриць для їх наступного ферментативного секвенування і проведення реакцій секвенування. Перший автоматичний ДНК-секвенатор було розроблено у 1987 р. фірмою AppliedBiosystems(США).

Для позначення знов синтезованих ланцюгів ДНК в умовах абл.ичи за автоматичного секвенування використовують молекулу будь-якої флуоресціюючої сполуки.

Автоматичні секвенатори ДНК керуються спеціально створеними комп’ютерними програмами. Так, наприклад, прибори фірми AppliedBiosystemsкомплектуються програмами збору і аналізу даних.

Сучасні автоматичні секвенатори набагато перевершують людину за продуктивністю, більш того, кожен рік такі автомати вдосконалюють. Усе це веде до того, що секвенування фрагментів ДНК стає простою процедурою, доступною для будь-якої молекулярно-біологічної лабораторії.

Розшифрування великих геномів прокаріотичних і еукаріотичних клітин потребувало поєднання зусиль різних лабораторій і формування абл.ич проектів.

У липні 1995 р. була опублікована перша абл.ичи послідовність повного генома (1830137 п.н.) самостійно існуючого організму – грамнехативної бактерії – Haemophilusабл.ич.

Першим еукаріотичним організмом, повна послідовність якого (12680000 п.н.) визначена у 1996 p., стали дріжджі Saccharomycescerevisiae. Це був результат зусиль значного числа дослідників, що працюють у лабораторіях і великих дослідних центрах країн Західної Європи, США і Японії.

Значні успіхи у розшифруванні послідовності молекул ДНК спричинили те, що у 1990 р. у США була прийнята офіційна програма щодо розшифрування генома людини (HumanGenomeProject, HGP), в межах якої планувалося за вкладення 3 млрд. доларів США завершити секвенування повного генома людини протягом 15 років. Основним виконавцем HGP стала компанія CeleraGenomics. Аналогічні проекти щодо генома людини почали реалізовуватися у Західній Європі, Японії, Росії.

У 2001 р. учасники американської програми HGP і Міжнародного консорціуму з секвенування генома людини, що поєднує численні наукові організації США, Великої Британії, Німеччини, Франції, Японії і Китаю, незалежно оголосили про завершення секвенування більшої частини (понад 95%) генома людини. На підставі отриманих даних стало можливим зробити ряд висновків про організацію генома людини.

Комп’ютерний аналіз дозволив виявити 26588 транскрибуючих і абл.ичи у білки генів, а також ще до 12 тис. передбачених генів. Екзони займають лише 1,1% генома, в той час як абл.и– 24%. Інша частина геному (75%) представлена міжгенними послідовностями. Число генів, виявлених у генома людини, лише удвічі більше, ніж у нематоди Caenorhabditiselegans (абл.. 4).

Отримані дані про структуру генома дозволяють значно поширити наше розуміння генетики людини, природи різноманітних спадкових хвороб. Інформація, що накопичується, дозволяє з’ясовувати молекулярні механізми патогенного впливу мікроорганізмів, вивчати захисні механізми, що реалізуються людиною, твариною, рослиною у відповідь на певну інфекцію. Це створює базу для ефективної розробки сучасних засобів і методів лікування інфекційних захворювань.

Таблиця 4

Дата добавления: 2017-02-01