Регуляция ферментативных реакций

Одновременно в каждой растительной клетке и во всем организме в целом происходят многие тысячи биохимических реакций, которые осуществляются строго согласованно в соответствии с генетической программой развития организма и функционированием механизмов адаптации растений к изменениям условий окружающей среды. При этом растения и другие высшие организмы представляют собой очень хорошо сбалансированные и эффективно действующие саморегулирующиеся системы. Это оказывается возможным благодаря тому, что в любых живых организмах имеются системы регуляции биохимических процессов, связанные прежде всего с воздействием на синтез и каталитическую активность ферментов.

В зависимости от особенностей синтеза все ферменты подразделяют на 2 группы – конститутивные и индуцируемые. Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в клетках организма независимо от их состояния и условий окружающей среды. Они катализируют жизненно важные и постоянно протекающие в организме биохимические реакции, например, реакции дыхания. Однако синтез многих других ферментов почти все время подавлен специфическими белками-репрессорами. Но действие белка репрессора, ингибирующего синтез фермента, прекращается при появлении в клетке определенного вещества, превращение которого катализирует данный фермент, или под воздействием какого-либо другого фактора, способного понижать ингибиторную активность белка- репрессора, при этом инициируется синтез белка – фермента, образующиеся при этом ферментные белки получили название индуцируемых ферментов.

Регуляция скорости реакций, катализируемых конститутивными ферментами, осуществляется с помощью аллостерических активаторов и ингибиторов, называемых аллостерическими эффекторами. Они способны связываться с определенным участком молекулы фермента, который пространственно удалён от каталитического центра, при этом происходит изменение конформации ферментного белка, вызывающее усиление или ослабление его каталитических свойств. Участок связывания аллостетического эффектора называют аллостетичеким центром фермента, а сами ферментные белки, имеющие аллостерический центр, получили название аллостерических ферментов. Связывание эффектора с аллостерическим центром фермента происходит на основе такой же специфической реакции, как и связывание субстрата с каталитическим центром ферментного белка.

Аллостерические ферменты чаще всего представляют собой олигомерные белки, в каждой субъединице которых имеются центры связывания для субстрата, ингибитора и активатора. Такой белок может находиться в двух конформациях, между которыми существует подвижное равновесие. В одной из них он связывает молекулы активатора, которые вызывают перестройку пространственной структуры ферментного белка и оптимизацию структуры каталитического центра (рис. 26). В другой конформации субъединицы аллостерического фермента связывают молекулы ингибитора, под действием которого ферментный белок переходит в неактивное состояние.

Общее число молекул фермента, находящихся в каталитически активной конформации, зависит от соотношения концентраций активатора, ингибитора и субстрата. При достаточно высокой концентрации ингибитора аллостерический фермент находится преимущественно в каталитически неактивной конформации и скорость ферментативной реакции очень сильно замедляется. А если в физиологической среде создаётся высокая концентрация активатора, то аллостерический фермент переходит в каталитически активную конформацию, обеспечивая ускорение катализируемой реакции. Роль активаторов и ингибиторов аллостерических ферментов выполняют биохимические метаболиты, образующиеся в ходе жизнедеятельности организма.

Так, например, связывание СО₂ с рибулозо-1,5-дифосфатом в ходе фотосинтеза катализирует аллостеричесий фермент рибулозодифосфаткарбоксилаза (см. гл. «Фотосинтез»). Аллостерическим активатором этого фермента служит фруктозо-6-фосфат, образующийся в процессе превращения и взаимодействия продуктов данной реакции, тогда как другой продукт реакций фотосинтеза фруктозо-1,6-дифосфат действует как аллостерический ингибитор фермента рибулозодифосфаткарбоксилазы. Если в хлоропластах в результате каких-либо нарушений прекращается превращение фруктозо-1,6-дифосфата во фруктозо-6-фосфат, то происходит накопление этого продукта и он аллостерически подавляет действие фермента рибулозодифосфаткарбоксилазы, вследствие чего скорость включения СО₂ в углеводные продукты фотосинтеза резко замедляется.

Активность дыхательного фермента фосфофруктокиназы, катализирующего фосфорилирование от АТФ фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо-1,6-дифосфата аллостерически активируется АДФ и ингибируется повышенной концентрацией АТФ. В процессе дыхательных реакций происходит окисление углеводов и др. органических веществ и образование биоэнергетических продуктов, в том числе АТФ. Если в ходе биосинтетических реакций АТФ подвергается гидролизу с образованием АДФ, то вследствие повышения концентрации АДФ аллостерически активируется фермент фосфофруктокиназа, под действием которого происходит активное включение в реакции дыхания фруктозо-6-фосфата, что через последующие этапы превращений приводит к образованию АТФ и таким образом концентрация этого биоэнергетического продукта поддерживается на определенном уровне. Если же потребление АТФ уменьшается и создается его высокая концентрация, то он начинает действовать как аллостерический ингибитор фермента фосфофруктокиназы, вследствие чего понижается скорость включения в реакции дыхания фруктозо-6-фосфата, что в свою очередь в целом понижает скорость дыхательных реакций и сопряженных с ними реакций синтеза АТФ.

У целого ряда аллостерических ферментов центры связывания активатора и ингибитора находятся в специальной субъединице ферментного белка, получившей название регуляторной субъединицы. Присоединяя к аллостерическому центру активатор или ингибитор, регуляторная субъединица претерпевает соответствующее конформационное изменение, вызывая перестройку пространственной структуры всей молекулы фермента, в том числе и тех субъединиц, в которых находятся каталитические центры.

Аллостерической регуляции, как правило, подвержены так называемые ключевые ферменты, которые катализируют лимитирующие стадии биохимических превращений, в ходе которых происходит сильное уменьшение свободной энергии. Ферменты, катализирующие другие этапы в данной цепи превращений, чаще всего не обладают аллостерическими свойствами, поэтому их действие в основном определяется концентрациями субстратов и образующихся продуктов. Почти всегда к лимитирующим стадиям, которые катализируют аллостерические ферменты, относятся первые реакции в цепях последовательных биохимических превращений и реакции, приводящие к ветвлению метаболических путей.

Наиболее распространены два вида аллостерических механизмов регуляции: ингибирование по типу отрицательной обратной связи и активация предшественником. Ингибирование по типу отрицательной обратной связи происходит в том случае, когда наблюдается накопление конечного продукта в цепи последовательных биохимических превращений, что может вызвать нарушение обмена веществ. Этот метаболит действует как аллостерический ингибитор, понижая активность ферментов, катализирующих лимитирующие стадии данного метаболического пути и в первую очередь фермента, который катализирует начальный этап превращений. По указанному механизму в рассмотренных ранее примерах аллостерически подавляется активность фермента фотосинтеза рибулозодифосфаткарбоксилазы при накоплении фруктозо-1,6-дифосфата или дыхательного фермента фосфофрукто-зокиназы высокой концентрацией АТФ. Причем необходимо отметить, что при высокой концентрации АТФ происходит одновременное аллостерическое ингибирование многих дыхательных ферментов (см. гл. «Дыхание»).

В ряде других реакций осуществляется регуляция опережающего типа (активация предшественником), когда образовавшийся метаболит аллостерически активирует фермент, катализирующий его превращение, или другой фермент в цепи последующих превращений. Так, например, осуществляется аллостерическая активация 3-фосфоглицериновой кислотой, возникающей в процессе фотосинтеза, фермента, катализирующего образование АДФ-глюкозы, необходимой для синтеза крахмала. Лимонная кислота, которая образуется в первой реакции цикла Кребса, действует как аллостерический активатор фермента изоцитратдегидрогеназы, катализирующей один из последующих этапов превращения лимонной кислоты. В настоящее время известно довольно много примеров опережающей аллостерической активации ферментов метаболическими предшественниками.

Биохимические продукты, образующиеся в ходе реакций одного метаболического пути, могут участвовать в аллостерической регуляции ферментов другого метаболического пути и благодаря этому формируется довольно сложная и хорошо сбалансированная система регуляции всех биохимических превращений, из которых складывается в целом обмен веществ организма. В результате существования такой перекрестной системы регуляции оказывается возможным переключение биохимических превращений с одного метаболического пути на другой. Так установлено, что продукт пентозофосфатного пути окисления глюкозо-6-фосфата 6-фос-фоглюконовая кислота аллостерически ингибирует фермент анаэробной стадии дыхания фосфофруктокиназу и, таким образом, переводит дыхательные реакции на пентозофосфатный путь окисления углеводов.

При рассмотрении схем регуляции ферментативных реакций следует отметить очень важную особенность. Если фермент представлен в организме набором изоферментов, то активность каждого изофермента регулируется разными метаболитами, что делает систему аллостерической регуляции метаболических реакций более лабильной и эффективной.

На рис. 27 показана схема возможной аллостерической регуляции синтеза двух биохимичеких продуктов из одного метаболического предшественника (А). Если по какой-либо причине увеличивается концентрация продукта Р₁, то он аллостерически ингибирует фермент Фсд и действует как аллостерический активатор на фермент Фск, переводя таким образом метаболические реакции на синтез продукта Р₂. Если же продукт Р₂ также будет накапливаться, то он аллостерически игибирует фермент Фск, а образующийся продукт С уже действует как аллостерический ингибитор фермента ФАВ, катализирующего начальную стадию превращений. В цепи превращений С→ Р₁ продукт Д алостерически активирует действие фермента Ф_EF, обеспечивая сдвиг равновесия в реакции ДD Е для образования продукта Е.

На примере рассмотренной схемы аллостерической активации показано лишь одно из звеньев довольно сложной общей системы метаболических взаимодействий в организме, включающей элементы множественной регуляции, когда один и тот же метаболит может аллостерически воздействовать на целую группу ферментов, катализирующих биохимические превращения в разных метаболических путях, объединяя их в единую регуляторную систему.

Быстрый перевод фермента в активную или неактивную форму может происходить также путем ковалентной модификации его молекул в результате присоединения фосфатных групп или нуклеотидных радикалов. В свою очередь ферменты, катализирующие ковалентную модификацию, регулируются по аллостерическому механизму.

Регуляция активности индуцируемых ферментов осуществляется как в процессе их синтеза, так и с участием аллостерических механизмов. Синтез ферментов, как и других белков, представляет собой довольно сложный биохимический процесс, который включает синтез рибосомной, транспортной и матричной РНК, называемый транскрипцией.

С участием рибосомной РНК происходит образование рибосом, которые при взаимодействии с матричной и транспортной РНК осуществляют синтез ферментных и других белков. Этот процесс называют трансляцией (см. гл. «Нуклеиновые кислоты»). Установлено, что у высших организмов регуляция синтеза ферментов может происходить как в процессе транскрипции, так и в процессе трансляции. Однако значительно лучше изучен механизм регуляции синтеза ферментов на уровне транскрипции. Принципиальная схема такого процесса представлена на рис. 28.

Основной регулируемый этап на этой схеме – это синтез матричной РНК (mРНК), катализируемый ферментом РНК-полимеразой. РНК-полимераза в результате специфического взаимодействия связывается с определенным участком молекулы ДНК – промотором, после чего фермент способен катализировать синтез mРНК. Однако действие РНК-полимеразы блокирует белок-репрессор, который имеет сильное химическое сродство к ДНК и прочно связывается с ней в акцепторной зоне, выключая таким образом процесс транскрипции (т.е. синтез mРНК).

Белок-репрессор относится к аллостерическим белкам. Аллостерическими эффекторами, воздействующими на белки-репрессоры в системе синтеза ферментов, являются или сами субстраты, которые должны превращаться с участием синтезируемых ферментов, или вещества, активируемые субстратами. И в том, и в другом случаях при поступлении в организм соответствующих субстратов происходит аллостерическая перестройка структуры белка-репрессора, вследствие чего уменьшается сродство этого белка к акцепторной зоне ДНК и он уже не препятствует действию фермента РНК-полимеразы, катализирующей синтез mРНК. И далее уже с участием mРНК синтезируются молекулы ферментного белка, который необходим для превращения поступившего субстрата. После того как произойдет полное превращение субстрата, его воздействие на белок-репрессор прекращается, вследствие чего восстанавливается сродство этого белка к ДНК и синтез mРНК снова блокируется.

Очень хорошо регуляция синтеза ферментов изучена у бактерий. У растений также известны индуцируемые ферменты, к ним относятся a-амилаза семян, нитратредуктаза и многие другие ферменты азотного обмена, некоторые протеолитические ферменты.

В ходе жизнедеятельности организмов синтез некоторых ферментов может ингибироваться конечными продуктами биохимических превращений по механизму отрицательной обратной связи. В этом случае накапливающийся конечный продукт взаимодействуя с аллостерическим центром белка-репрессора, усиливает его сродство к ДНК, в результате чего белок- репрессор связывается с ДНК в акцепторной зоне и останавливает транскрипцию генов, кодирующих структуру полипептидов данного ферментного белка. Вследствие понижения концентрации фермента уменьшается скорость катализируемой им биохимической реакции и выход образующихся продуктов, что в свою очередь окажет соответствующие влияние на всю цепочку последовательных биохимических превращений в соответствии с принципами смещения равновесия в химических реакциях и, как следствие, понизит концентрацию конечного продукта.

Эффективность регуляции ферментативных реакций путём воздействия на синтез ферментов в значительной степени определяется периодом полужизни ферментов. Чем дольше сохраняется активность фермента после прекращения его синтеза, тем менее эффективна регуляция ферментативной реакции и потребуется достаточно много времени, чтобы полностью её остановить (несколько часов или даже дней). В свою очередь период полужизни фермента зависит от скорости его инактивации в клетке и гидролитического расщепления протеолитическими ферментами.

Таким образом, синтез и деградация ферментов находятся в динамическом равновесии и регуляция активности ферментов на этом уровне проходит сравнительно медленно. Более быстрое регулирование происходит с участием аллостерических ферментов и посредством механизма ковалентной модификации ферментных белков. В этом случае регуляторное воздействие направлено непосредственно на ферменты.

Некоторые ферменты синтезируются в виде проферментов (зимогенов), представляющих собой каталитически неактивные белки, которые могут переходить в каталитически активную форму в результате отщепления от их молекул определенных полипептидов, восстановления дисульфидных группировок (-S-S-) в тиоловые группы (-SH), ковалентной модификации молекулы путем фосфорилирования и др. Синтезированные на рибосомах эндоплазматического ретикулума проферменты очень часто упаковываются в зимогенные гранулы, которые могут перемещаться к поверхности клетки или даже секретироваться в окружающую среду. В виде зимогенных форм синтезируются многие пищеварительные ферменты человека и животных (пепсин, трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы), растительный фермент папаин, некоторые гидролитические ферменты семян растений (амилазы и протеазы).

Важными компонентами регуляторной системы растений являются фитогормоны. Благодаря тому, что они легко переносятся по сосудам флоэмы, эти физиологически активные соединения могут выполнять функцию переноса регуляторных сигналов от одних тканей или органов растения к другим, вызывая активацию и синтез определенных ферментов.

Действие гормонов на активацию биохимических процессов может осуществляться двумя путями. Первый путь - это быстрое регуляторное воздействие, связанное с активацией ферментов путем ковалентной модификации. В этом случае гормон соединяется с определенным белком в составе клеточной мембраны, который называют рецепторным белком. Характер взаимодействия гормона с белком-рецептором примерно такой же, как и специфичность связывания эффектора с аллостерическим центром фермента. Под действием гормона происходит конформационное изменение рецепторного белка в составе мембраны, которое инициирует перестройку всей мембранной структуры, вызывая активацию связанных с мембраной ферментов. В свою очередь с участием этих ферментов приводится в действие рассмотренный выше механизм ковалентной модификации ферментных белков, катализирующих различные метаболические реакции в клетке.

Другой путь связан с воздействием гормонов на регуляторную систему синтеза ферментных белков. На основе специфической реакции гормон соединяется с цитоплазматическим белком–рецептором. Затем образовавшийся гормон–рецепторный комплекс перемещается в ядро и взаимодействует там с регуляторным белком, инициируя или замедляя процесс транскрипции соответствующего гена. В опытах по изучению действия фиторегуляторов выяснено, что ауксины, цитокинины и гибберелловая кислота усиливают синтез многих белков и всех форм РНК в цитоплазме, тогда как абсцизовая кислота оказывает на указанные процессы противоположное действие. В других экспериментах также показано, что ауксины могут активировать в цитоплазме синтез кислых гидролаз, цитокинины - фермента нитратредуктазы, гиббереллины - образование в прорастающих зерновках злаков a-амилаз, катализирующих гидролитическое расщепление молекул крахмала.

В растениях как фитотрофных организмах многие биохимические процессы регулируются светом, который воспринимают в качестве регуляторного сигнала рецепторные белки – фитохром и флавопротеиды, способные при поглощении света определенной длины волны переходить в активную конформацию и вызывать активацию или даже синтез ферментов.

Фитохром представляет собой белок с молекулярной массой ~120000, состоящий из двух полипептидных субъединиц и включающий светочувствительную группировку – хромофор, который образуется из четырех линейно соединенных пиррольных группировок с определенным набором боковых радикалов. При поглощении красного света (660 нм) в структуре одной из пиррольных группировок происходит изомеризация двойных связей, вызывающая конформационную перестройку молекулы белка.

Активированный светом белок связывается с клеточной мембраной и вызывает регуляторное действие примерно по такому же механизму, как и гормоны. Если же активная форма фитохрома поглощает свет с длиной волны 730 нм, то инициируется фотоизомеризация хромофора в обратном направлении, вследствие чего фитохром превращается в неактивную форму. В ряде опытов установлено, что фитохром регулирует активность ферментов, катализирующих реакции фотосинтеза (фруктозо-1,6-дифосфатаза, глицеральдегидфосфатдегидрогеназа), проницаемость клеточных мембран в листьях, синтез гормонов.

Другая группа фотосенсорных белков представлена флавопротеидами. У них хромофором служит флавиновая группировка, способная подвергаться фотохимическому превращению под воздействием синего света.

Дата добавления: 2014-01-11