Методи визначення первинної структури білка

Рівні просторової організації біополімерів

Звичайно при розгляді просторової організації біополімерів виділяють чотири рівні: первинну, вторинну, третинну і четвертинну структуру. Хоча такий поділ значною мірою умовний, він досить корисний для систематизації наших знань про будову біополімерів.

Первинна структура білка - це послідовність розташування амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі. Первинною структурою називають порядок, у якому мономерні одиниці зв'язані між собою ковалентними зв'язками. На Землі не було, немає і не буде двох людей з цілком однаковим набором білків.

1) Роз'єднати поліпептидні ланцюги (порушити ІVcтруктуру) – 8М розчином сечовини.

2) Порушити дисульфідні зв'язки (ІІІ структуру) – окисненням надмурашиною кислотою або відновленням b-меркаптоетанолом, тіогліколевою кислотою.

3) Методом гідролізу визначають амінокислотний склад (розчин хлоридної кислоти або ферментативно).

4) Ферментативні методи часткового гідролізу поліпептидів на маленькі пептиди (фрагменти): Щоб ферменти не забруднювали досліджуваний білок, застосовують нерозчинні препарати ферментів на спеціальних носіях – іммобілізовані ферменти.

Трипсин – має високу специфічність розщеплює пептидний зв¢язок утворений аргініном та лізином.

Пепсин – фенілаланін, тирозин, глютамінова кислота

Хімотрипсин – гідролізує зв¢язки, утворені карбоксильними групами триптофану, фенілаланіну, тирозину, метіоніну. Після цього розділяють окремі пептиди і визначають їх амінокислоти.

5) З'ясовують хімічну природу кінцевих а.к.

Хімічні методи:

N - кінцева: – реакція Сенджера – розчин поліпептиду обробляють 2,4-динітрофторбензеном в лужному середовищі, який приєднується до NH₂– групи N -кінцевої амінокислоти– жовтий колір. Далі гідроліз поліпептиду, хроматографія амінокислот. Тільки амінокислота з ДНФБ жовтого кольору.

– фенілтіогідантоїновий метод Едмана, можна багаторазово використовувати. На білок діють фенілізотіоціанатом. Обробка поліпептида хлоридною кислотою НСl в розчині органічного розчинника призводить до циклізації та звільнення фенілтіогідантоїна N -кінцевої амінокислоти. Цей метод – хімічна основа роботи секвенатору – автоматичного приладу для визначення послідовності амінокислот у поліпептидах. Для ідентифікації фенілтіогідантоїну використовують тонкошарову, газорідинну хроматографію.

С-кінцева амінокислота: використовують метод гідразинолізу NH₂NH₂: молекула білку обробляється гідразином. При цьому С -кінцева амінокислота відщеплюється в незмінному вигляді, а всі інші амінокислоти у вигляді гідразидів 2,4-динітрофторбензену.

Дата добавления: 2014-10-22