Приготовление срезов

Фиксация

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путем их химического сшивания.

Фиксирующая жидкость. Быстрое проникновение химического фиксатора в живую ткань — условие сохранности структур in situ. Наиболее распространенные фиксаторы — формалин, спирты, глутаральдегид. Небольшие кусочки ткани фиксируют, помещая их в раствор фиксатора. Целые органы перед выделением перфузируют, т. е. прокачивают фиксатор через сосудистую систему органа.

Криофиксация. Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (-196 градусов Цельсия).

Лиофилизация — один из способов подготовки материала. Небольшие кусочки ткани подвергают быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Последующее высушивание в вакууме вызывает возгонку льда. Метод позволяет исключить обработку ткани в промежуточных средах (обезвоживание и заливка).

Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в нее сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующей смесей (большинство фиксаторов — водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды — обезвоживание в спиртах возрастающей от 60 до 100 градусов крепости.

Заливка — необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает ее раздавливание и сминание при резании, дает возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространенная среда для заливки — парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы.

Микротом. Серийные и отдельные срезы различной толщины и площади для СМ готовят при помощи специального устройства — микротома. Стальной нож микротома позволяет получить срезы толщиной 3-8 мкм из залитых в парафин, целлоидин или полиэтиленгликоль кусочков ткани. Стеклянные или алмазные ножи позволяют получить срезы толщиной 1-5 мкм из материала, залитого в смолу. Приготовленные для последующей световой микроскопии срезы монтируют на предметное стекло.

Микротом — устройство для получения гистологических срезов. Различают санные и ротационные микротомы. Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования.

Криостат. Если фиксация приводит к инактивации предполагаемых для изучения молекул (например, ферментов, биогенных аминов), используют криостат, позволяющий получить срезы толщиной 5-25 мкм в термически изолированной камере с низкой и регулируемой температурой.

Ультратом (ультрамикротом) позволяет получить срезы из материала, залитого в смолу. При помощи стеклянных или алмазных ножей готовят ультратонкие срезы толщиной от 0,08-0,1 (ЭМ) до 0,5 мкм.

Вибротом. Для получения тонких срезов фиксированных и нефиксированных тканей без замораживания используют вибротом.

Замораживание-скалывание — подготовка материала к микроскопии методом криосколов.

Мазки и смывы готовят для микроскопии высушиванием на предметном стекле либо краткровременной фиксацией.

Дата добавления: 2015-04-30