Замороженные срезы

Выявление элементов нервной системы

Окраска клеток соединительной ткани и крови

1. Окраска азур-2-эозином. Базофильные элементы окрашиваются азуром-2 в тёмно-синий, а оксифильные - в светло-красный цвет.

2. Окраска мазков по методу Романовского. Краситель - тот же, что и в предыдущем случае (азур 2 – эозин). Отличия же от приготовления срезов: фиксацию мазков проводят чистым метанолом; окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не 12-14 ч; для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам. Эритроциты приобретают бледно-красный цвет, цитоплазма лейкоцитов - голубой или синий цвет, цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.

1.Импрегнация нитратом серебра. Особенности предварительной обработки препарата: фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней. Уплотнение образца осуществляют не путём заливки в парафин (или целлюлозу), а путём замораживания. Срез готовят на специальном замораживающем микротоме. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами азотнокислого серебра, формалина, аммиачного серебра. Элементы нервной системы (волокна, клетки и т.д.) окрашиваются в чёрный цвет, окружающие ткани - в светло-коричневый цвет.

Замораживающий микротом — это микротом, имеющий специальное устройство для замораживания объекта, позволяющее резать нефиксированный, свежий материал.

Замораживающие микротомы используют для резки не залитых, но фиксированных объектов, материала, залитого в желатин и водорастворимые пластмассы. Особенно широко применяются замораживающие микротомы для изготовления препаратов при исследовании материала срочных биопсий. По своей конструкции замораживающие микротомы относятся к микротомам санного типа, но в их устройстве есть некоторые особенности. Станина имеет приспособление для крепления к столу. Нож устанавливают под нужным углом в подвижной ручке с помощью одного или двух зажимов. Автоматическая подача осуществляется при каждом размахе ручки с ножом через систему рычагов. Замораживающий столик снабжен приспособлением для подачи углекислоты или охлаждается термоэлектрически с помощью полупроводниковых элементов.

Замораживающий столик гибким шлангом соединен с металлическим баллоном, в котором находится жидкая углекислота.

Криостат - специализированная холодильная камера с установленным в ней микротомом, в которой имеются отверстия для рук, люминесцентная лампа и смотровое стекло. Надежная изоляция позволяет поддерживать в криостате температуру от -5 до -25 °С. Отрицательными моментами при работе с криостатом являются значительное переохлаждение рук оператора, недостаточная освещенность рабочего поля, а также невозможность ориентировать объект относительно кромки ножа.

Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидкого азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.

Для получения качественного замороженного среза необходимым условием является быстрое замораживание ткани, при котором вода не кристаллизуется, а переходит в состояние аморфного льда.

Скорость замораживания, в первую очередь, ограничивается скоростью теплопереноса. Ткань биопсийного материала сама по себе обладает низкой теплопроводностью. Поэтому быстро и равномерно охладить образец большого объема без повреждений невозможно. Для обеспечения максимальной скорости охлаждения биоптат следует замораживать в жидкой среде. Эта жидкость (хладагент) должна иметь точку плавления ниже температуры инициации кристаллизации воды - 70°С. Этому требованию удовлетворяет ряд алканов - это пентан, 2-метилбутан (изопентан), n-гексан, гептан.

Поставленная в работе цель, таким образом, достигается путем замораживания ткани в n-гексане, охлажденном до температуры плавления (-95°С), в форме пластинки толщиной не более 3 мм и изготовлением из нее в криостате срезов толщиной менее 7 мкм по стандартной методике, с последующей быстрой фиксацией и окраской.

Техническое описание способа

Изготовление срезов из свежезамороженной ткани включает в себя 3 шага:

- получение блока замороженной ткани в форме пластинки толщиной не более 3 мм с минимумом кристалликов льда;

- получение среза толщиной менее 7 мкм из блока и быструю фиксацию среза на предметном стекле, окрашивание стандартным красителем (гематоксилин-эозин, азур-эозин и т.п.);

- заключение под покровное стекло. В результате получается препарат длительного хранения (постоянный препарат).

1. Замораживание биоптата. Пластиковый стакан, объемом не менее 50 мл, заполняется n-гексаном, не менее 30 мл, и затем для увеличения теплоизоляции помещается в подставку из пенопласта с толщиной стенки не менее 4 см.

2. В стакан добавляется жидкий азот для доведения n-гексана до кашеобразного состояния (смесь жидкого и твердого вещества).

3. Из биоптата вырезается пластинка ткани толщиной 2-3 мм, которая быстро погружается в стакан с охлажденным n-гексаном.

4. Далее стакан с материалом переносится в рабочую камеру криостата (температура камеры - 20°С) и через 30 с. замороженный кусочек вынимается из стакана и перемещается на фильтровальную бумагу в рабочей зоне камеры криостата, для удаления излишков n-гексана.

5. Изготовление среза толщиной менее 7 мкм из замороженной пластинки производится стандартным методом. Срез переносится на предметное стекло и немедленно помещается в спиртоальдегидный раствор при комнатной температуре (20-25°С) на 3 мин, затем отмывается проточной водой от фиксатора в течение 30 с и окрашивается гистологическими красителями обычным образом.

6. Окрашенные срезы заключаются под покровное стекло в водорастворимую среду, либо обезвоживаются в органической среде, и заключаются в синтетическую органическую среду.

Приготовленные в криостате срезы расправляют кисточкой на предметном стекле, переносят в плотно закрытый стаканчик с холодным (5—10%) ацетоном и помещают в баню с сухим льдом или же в камеру криостата. Срок фиксации зависит от толщины срезов (в среднем 5—10 мин можно хранить и несколько дней).

Полученные таким способом срезы позволяют изучать общий рисунок тканей биоптата, а также детали клеточного строения, позволяющие выявлять отдельные опухолевые клетки.

Дата добавления: 2015-04-30