Хід роботи. Матеріали та обладнання

Матеріали та обладнання

Реактиви

1. Суміш розчинників н -бутанол, оцтова к-та, вода в об¢ємному співвідношенні 4:1:5 (40 мл н -бутанолу, 10 мл оцтової к-ти, 50 мл дист. води) струшують протягом 1-2 хв. в ділильній воронці. Після розшарування нижній шар зливають, а верхній використовують як рухому фазу.

2. 0,5%-й розчин нінгідрину в ацетоні (95 частин 0,5%-го розчину нінгідрину в ацетоні, 1 частина льодяної оцтової к-ти і 4 частини води) змішують безпосередньо перед визначенням.

3. 0,03 М розчини різних амінокислот (наважку амінокислот, що відповідає 0,03 М розчину, розчиняють в 0,01 н соляній кислоті).

4. Розчини суміші амінокислот невідомої концентрації.

Силуфолові пластинки, шприци, контейнери з кришкою для суміші розчинників, контейнери з кришкою для розчину нінгидрину, витяжна шафа, термостат або сушильна шафа, лінійка, олівець

Підготовка до проведення лабораторної роботи

На лабораторному столі знаходяться розчини амінокислот та розчини суміші невідомих амінокислот.

Студенти розділяються на бригади по 4 особи.

Кожна бригада одержує 3 розчини визначених для неї амінокислот та 1 невідому суміш амінокислот.

1 бригада – аспарагінова к-та, валін, треонін. Суміш №1

2 бригада – валін, аспарагінова кислота, метіонін. Суміш №2

3 бригада – гліцин, глутамінова кислота, фенілаланін. Суміш №3

4 бригада – гістидин, лейцин, валін. Суміш №4

5 бригада – треонін, глутамінова кислота, лейцин. Суміш №5

6 бригада – аспарагінова кислота, аргінін, валін. Суміш №6

7 бригада – треонін, фенілаланін, серин. Суміш №7

8 бригада – метіонін, лейцин, гліцин. Суміш №8

9 бригада – фенілаланін, серин, гістидин. Суміш №9

Лаборант видає кожній бригаді 1 силуфолову пластинку. Щоб запобігти забрудненню силуфолової пластинки її необхідно тримати за бокові грані.

Студенти проводять попереднє тренування в нанесенні води на звичайний папір за допомогою шприца. Олівцем підписують пластинку (прізвище та № бригади).

Члени бригади беруть по 1 колбі з розчинами відомих амінокислот (за номером бригади), наносять їх на пластинку і повертають розчини на стіл.

На силуфоловій пластинці олівцем відмічають лінію старту (1,5-2 см від нижнього краю пластинки) та 4 точки для нанесення розчинів суміші відомих амі­нокислот та розчину невідомої суміші.

  лінія фінішу

    лінія х х х х страту 1 2 3 4  

Нанесення точок на силуфолову пластинку

За допомогою шприца на точки 1, 2, 3 наносять однакові об'єми розчину відомих амінокислот (по 4 краплі), причому кожну наступну краплину наносимо після просушування попередньої на повітрі. На точку 4 наносять такий же об¢єм розчину суміші невідомих амінокислот.

Після нанесення всіх розчинів амінокислот пластинку висушують на повітрі і розміщують в герметичному контейнері, на дно якого наливають шар розчинника (елюента) товщиною 1,0 см так, щоб нижній край пластинки був занурений на 0,5-1,0 см в розчинник. Необхідно слідкувати, щоб поверхня розчинника була нижче від лінії старту на 0,5-1 см. Верхній край пластинки закріплюють тримачем. Щоб уникнути випаровування елюента, хроматографію проводять в закритих камерах, що забезпечує рівновагу між рухомою рідкою фазою та її парами. Робота з органічними розчинниками прово­диться у витяжній шафі.

Відмічаємо час початку та закінчення хроматографії. Під час проведення хроматографії спостерігають за рухом фронту розчинника (розгонка). Хроматографія вважається закінченою, коли фронт руху розчинник знаходиться за 1-1,5 см від верхнього краю пластинки.

Після закінчення хроматографічного розд­ілення амінокислот пластину дістають з контейнера, висушують на повітрі до наступного дня в чистій витяжній шафі при кімнатній температурі. Щоб визначити місцезнаходження невидимих плям амінокислот, тобто проявити пластинку, її обробляють реактивами, специфічними для речовин що розділяються. У випадку амінокислотних сумішей пластину занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 %-м розчином нінгідрину в аце­тоні, просушують на повітрі і протягом 15 хвилин прогрівають для проявлення забарвлення в термостаті при 60 °С.

На проявленній та висушеній хроматограмі плями амінокислот обмальовують олівцем, щоб зберегти місцезнаходження окремих амінокислот, ідентифікують плями відомих амінокислот та визначають амінокислотний склад невідомої суміші, порівнюючи положення окремих її плям з положенням стандартів.

Відносне положення амінокислот на хроматограмах, отриманих з суміші н-бутанол—оцтова кислота—вода, показано на малюнку 1.

Малюнок 1.Відносне положення амінокислот на хроматограмах:

1 - цистин; 2 - лізин; 3 - гістидин; 4 - аргі­нін; 5 - аспарагінова кислота; 6- серин; 7 - гліцин; 8 - глутамінова кислота; 9 - треонін; 10- аланін; 11- про­лін; 12 - тирозин; 13 - метіонін; 14 - валін; 15 - фенілаланін; 16 - лейцин (ізолейцин).

Вимірюючи відстань між лінією старту і центром плями кожної амінокислоти, знаходять величину хроматографічної рухомості R_f (відношення довжини пробігу кожної плями амінокислоти до довжини пробігу розчинника, яка вимірюється відстанню між стартовою лінією та лінією фінішу розчинника).

Дата добавления: 2015-05-23