Теоретичні відомості. Тема: Визначення концентрації розчинного білку з біуретовим реактивом та за методом Лоурі

Тема: Визначення концентрації розчинного білку з біуретовим реактивом та за методом Лоурі.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №4

Губський Ю.Г. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль.: ”Укрмедкнига”, 2000.-С. 18-36.

Висновок

ЛІТЕРАТУРА

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. -М.: “Медицина” 1990.-С.17-63.

3. Николаев А.Я. Биологическая химия. - М.: ”Высшая школа”, 1998.-С.9-52.

4. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия.- М.-С-П.: “Издательство Бином-невский Диалект”, 1999. -368 с.

5. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. - М.: “Мир” 1993. 384 с

(4 годин)

Мета: навчитися визначати концентрацію білку в розчині за методом Лоурі.

Серед методів, заснованих на кількісному визначенні білків за допомогою кольорових реакцій, найпоширенішим є метод Лоурі. Як і всі методи засновані на кольорових реакціях метод Лоурі дає абсолютні дані про вміст білків тільки в тому випадку, якщо калібрувальний графік побудований по тому ж самому білку, визначення якого ведуть за допомогою кольорової реакції.

Метод Лоурі дає змогу виміряти інтенсивність забарлення розчину, у якому одночасно здійснюються щонайменше дві кольорові реакції на білок: біуретова реакція й реакція Фоліна з тирозиновим і цистеїновим радикалами білкової молекули. Остання полягає у відновленні суміші фосфорно-вольфрамової та фосфорно-молібденової кислот (реактив Фоліна) з утворенням комплексного з'єднання синього кольору.

Вважають, що в реакції відновлення беруть участь комплексні з'єднання міді, що утворилися при взаємодії білку в лужному розчині мідного купоросу.

Друга зі згаданих реакцій не дуже специфічна, зате досить чутлива. Тому метод Лоурі дозволяє вести визначення білків у дуже розведених розчинах, де кількість їх виражається всього лише десятками мікрограмів, і, як правило, застосовується для визначення білку в елюатах фракцій, що вийшли з колонки при фракціонуванні на іонообмінних смолах або сефадексах.

Принцип методу заснований на властивості білків утворювати забарвлені комплекси синього кольору при сумісній дії двох кольорових реакцій - біуретової і реакції Фоліна (відновлення білками суміші фосфатно-

вольфрамової та фосфатно-молібденової кислот - реактиву Фоліна). Синє забарвлення, що виникає, в основному визначається реакцією фенольного реагенту (реактив Фоліна-Чікольте) з залишками амінокислоти Tyr, деякий вклад вносять інші амінокислоти Trp, His, Cys та пептидні зв¢язки.

Інтенсивність забарвлення комплексів вимірюють на фотоелектроколориметрі (ФЕК) при довжині хвилі 750 нм чи на спектрофотометрі.

Метод відзначається високою чутливістю: виявляє 0,005 – 0,1 мг/мл білка в пробі.

Самостійна робота студентів

1. Для побудови калібрувального графіка приготувати стандартний розчин альбуміну.

2. З стандартного розчину альбуміну з концентрацією 100 мг/мл приготувати робочі розчини (для кожної концентрації зробити 3 розчини).

3. Виміряти оптичну щільність кожної концентрації за методом Лоурі проти контрольної проби, що містить замість розчину білку 0,9% розчин NaCl.

3. Побудувати калібрувальну криву.

4. Визначити концентрацію білків невідомих розчинів

5. Порівняти значення одержані біуретовим методом, біуретовим методом за модифікацією Яроша та методом Лоурі.

6. Написати висновок.

Дата добавления: 2015-05-23