Хід роботи. Цитохроми відіграють важливу роль в метаболізмі ксенобіотиків в організмі людини (метаболізують біля 60% лікарських речовин)

Мал. Будова гема

Цитохроми відіграють важливу роль в метаболізмі ксенобіотиків в організмі людини (метаболізують біля 60% лікарських речовин), здійснюють реакції окиснення молекулярним киснем органічних сполук і є важливим елементом системи детоксикації ксенобіотиків. Локалізовані, в основному, в мембранах, а в еукаріотів (рослини та тварини) - в мітохондріальних мембранах та ендоплазматичному ретикулумі.

Цитохром Р₄₅₀ має широку субстратну специфічність, утворює свою ізоформу для кожного субстрату. Сім¢я ізоформ цитохрому Р₄₅₀ бере участь в великій кількості реакцій з ксенобіотиками. Цими субстратами можуть бути нормальні клітинні компоненти, метаболіти таких реакцій вводяться в шляхи метаболізму клітин. Однак субстратами цитохрому Р₄₅₀ можуть бути речовини, що не є компонентами клітин живих організмів. Це можуть бути хімічні сполуки, лікарські засоби. Цитохром Р₄₅₀ може приймати участь в детоксикації чужорідних сполук (ксенобіотиків). В цих випадках під дією цитохрома Р₄₅₀ сполуки перетворюються в продукти, що можуть мати цитостатичні, мутагенні та канцерогенні властивості.

Цитохром b₅. Мембранний білок, що каталізує перенесення електронів, входить до складу білків ендоплазматичних мембран. Має 93 амінокислотних залишки і одну гемову групу, що пов¢язана з білком двома гістидиновими залишками, які є аксиальними лігандами. Цитохром b5 є одним з компонентів системы цитохрому Р₄₅₀. Цитохром b₅ є гемопротеїном, гемова група представлена гемом. Фермент (мікросомальна ізоформа) бере участь в окисно-відновних реакціях, що проходять в клітинах організму, в якості переносника

електронів. Всі відомі ізоформи цитохрому b₅ можна разділити на 2 групи - розчинні та мембранопов'язані. Розчинна форма локалізована в еритроцитах. Мембранопов'язана ізоформа цитохрому b₅ має мітохондріальну і мікросо-мальну формы, які пов'язані з відповідними органелами клітин в органах і тканинах.

Самостійна робота студентів

1. Вирахувати за спектрами поглинання D D для цитохрому Р₄₅₀;

2. Вирахувати за спектрами поглинання D D для цитохрому b₅;

3. Вирахувати концентрацію білку в розчині, якщо відомо об¢єм білку відомої концентрації взятий для дослідження;

4. Розрахувати вміст цитохромів Р₄₅₀ та b₅ за спектрами поглинання, якщо відомо:

- концентрацію білку у розчині;

- коефіцієнт молярної екстинкції цитохрому Р₄₅₀ (табличні дані);

- коефіцієнт молярної екстинкції цитохрому b₅ (табличні дані).

5. Написати висновок.

Вимірювання вмісту цитохромів b₅ та Р₄₅₀ проводяться в суспензії мікросом, виділених з гомогенатів печінки щурів за допомогою 2-променевого спектрофотометра (див. мал.).

Визначення вмісту цитохрому b₅ основано на величині поглинання відновленої форми (min при 409 нм та max при 428 нм):

ΔD для цит b₅ = поглинання при 428нм – поглинання при 408нм

Вміст цитохрому b₅ в мікросомальній фракції розраховували за допомогою коефіциєнта молярної екстинкції для цит. b₅ =164. 10³ см ^{-1 .} М ^-1.

Вміст цитохрому Р₄₅₀ вимірюється величиною поглинання комплекса відновленого цитохрома з оксидом (СО) при 450 нм.

ΔD для цит Р₄₅₀ = поглинання при 450нм – поглинання при 490 нм

Вміст цитохрому Р₄₅₀ в мікросомальній фракції розраховували за допомогою коефіциєнта молярної екстинкції для цит. Р₄₅₀ = 91. 10³ см ^{-1 .} М ^-1.

Коефіцієнт молярної екстинкції або молярний коефіцієнт поглинання – це поглинання 1 М (одномолярного) розчину даної речовини або білку в кюветі товщиною 1 см.

Таблиця молярних коефіцієнтів поглинання деяких цитохромів

Назва речовини	Довжина хвилі, нм	Молярний коефіцієнт поглинання, М^-1 × см^-1
Цитохром с		29,5 × 10^3
Цитохром Р420		110 × 10^3
Цитохром Р450		91 × 10^3
Цитохром b5		164 × 10^3

Рис. Спектр поглинання відновленого цитохрому b₅ та відновленого цитохрому Р-450 у присутності СО

Присутність в білках іонів перехідних металів (у цитохромах b₅ та Р₄₅₀ це атом Fe²⁺) дозволяє застосувати широкий набір фізичних методів дослідження таких як спектроскопія.

Основне рівняння квантової теорії випромінення та поглинання виглядає так: DЕ = Е₂ – Е₁ = hn,

де Е₁ та Е₂ – енергія двох квантових рівнів, між якими здійснюється перехід;

h - стала Планка, постійна величина;

n - число довжин хвиль енергії, що випромінюється або поглинається.

За допомогою закону Ламберта-Бера можна встановити зв¢язок між поглинанням і природою білку, що поглинає. Згідно цього закону

I₀

DD = lg ----- = e × c × l × концентрація загального білку, мг/мл (1)

I

де I₀ - інтенсивність світового пучка, що падає на розчин білку;

I - інтенсивність світового пучка, що виходить після розчину білку;

e - молярний коефіцієнт поглинання, (М^-1 × см^-1), величина, що

приводиться в спеціальних таблицях;

c - концентрація білку, який поглинає світло, тобто концентрація

ферментного білку, моль/л;

l - товщина поглинаючого шару, см. Для спектрофотометра це

товщина кювети, в якій знаходиться розчин (l = 1 см).

З формули (1) визначаємо

D D

с = ----------------------------------------- = А мілімоль/мл, де

e × l × конц.заг.білку в мг/мл

DD = I – I₀ поглинання білкового розчину, вимірюється спектрофотометром;

e - коефіциєнт молярної екстинкції для цит. b₅ =164. 10³ см ^{-1 .} М ^-1;

e - коефіциєнта молярної екстинкції для цит. Р₄₅₀ = 91. 10³ см ^{-1 .} М ^-1;

l = 1 см

1 М × см × мл мілімоль × мл

с = ------------------------------ = ---------------- = -------------------

М^-1× см^-1 ×см × мг_білку/мл см × мг_білку мл × мг_білку

Дата добавления: 2015-05-23