Хід роботи. Матеріали та обладнання

Матеріали та обладнання

Визначення концентрації розчинного білку з біуретовим реактивом в модифікації Ярош

Мета роботи: навчитися визначати концентрацію білку в розчині з біуретовим реактивом в модифікації Ярош.

Метод використовується в розчинах білків з концентрацією від 0,04 до 1,6 мг/мл.

Самостійна робота студентів

1. Для побудови калібрувального графіка приготувати стандартний розчин альбуміну.

2. З стандартного розчину альбуміну з концентрацією 100 мг/мл приготувати робочі розчини (для кожної концентрації зробити 3 розчини).

3. Виміряти оптичну щільність кожної концентрації за допомогою біуретової реакції в модифікації Ярош проти контрольної проби, що містить замість розчину білку фізіологічний розчин.

3. Побудувати калібрувальну криву.

4. Визначити концентрацію білків невідомих розчинів

5. Порівняти значення одержані двома методами та написати висновок.

1. Фотометричне обладнання здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 540-560 нм в діапазоні 0-1,0 одиниць оптичної щільності;

2. Кювети з довжиною оптичного шляху 5 мм;

3. Аналітичні ваги

4. Термостат на 40⁰ С

5. Колба мірна ємністю 500 мл,

6. Штатив з пробірками ємністю 10 мл;

7. Піпетки місткістю 0,1; 1,0 та 5,0 мл

8. Міліметровий папір, олівець, лінійка

Реактиви

1. В мірну колбу на 1 л наливають 400 мл 0,2 н р-ну NaOH, додають 9 г

калій-натрію виннокислого, перемішують до повного розчинення, додають 3 г CuSO₄×5H₂O (порошок) та 5 г КJ. Об'єм доводять до мітки 0,2 н р-ном NaOH.

2. До 300 г сечовини (карбаміду) додають кусок тимолу величиною з

горошину, приливають 700 мл дистильованої води. Суміш підігрівають, додають 3 г активованого вугілля, перемішують та фільтрують в мірну колбу на 1 л. Об'єм доводять до мітки дистильованою водою.

3. Розчини білків невідомої концентрації (2-3 розчини).

1. Побудова калібрувальної кривої.

Калібрувальну криву будують з використанням яєчного альбуміну. Для побудови беруть 6 пробірок і готують розчини білку в воді з концентрацією 10, 20, 30, 40, 50, 60 мг білку в 10 мл. З одержаних розчинів відбирають в окремі пробірки по 0,1 мл. В 7-му пробірку наливають 0,1 мл води (контрольна проба). Потім у всі пробірки додають 2,4 мл розчину сечовини та 2,5 мл біуретового реактиву. Суміш старанно перемішують, інкубують в термостаті при 40⁰ С протягом 10 хвилин, охолоджують до 20⁰ С. Через 30 хвилин після додавання біуретового реактиву розчин колориметрують на ФЕК при довжині хвилі 540 нм в кюветі 5 мм проти контрольної проби (7-ма пробірка).

2. Визначення невідомих концентрацій розчинів білків

В три пробірки приливають 2,4 мл розчину сечовини, в 1-шу пробірку додають 0,1 мл води (контроль), в 2-гу та 3-тю – по 0,1 мл розчинів білків невідомої концентрації. Потім у всі пробірки додають 2,5 мл біуретового реактиву. Суміш старанно перемішують і інкубують в термостаті при 40⁰ С протягом 10 хвилин, потім охолоджують до 20⁰ С. Через 30 хвилин після додавання біуретового реактиву розчин колориметрують на ФЕК при довжині хвилі 540 нм в кюветі 5 мм проти контрольної проби (1-ша пробірка). Концентрацію білка в г/л визначають по калібрувальній кривій.

Калібрувальна крива представлена на малюнку:

Мал. Калібрувальна крива залежності оптичної щільності від вмісту білку біуретовим методом в модифікації Ярош

Дата добавления: 2015-05-23