Хід роботи. Матеріали та обладнання

Матеріали та обладнання

Реактиви

1. Ліофілізований альбумін для приготування 5 мл калібрувального розчину (100±5) г/л або 5 мл готового розчину альбуміну;

2. Біуретовий реактив (3,9 г CuSO₄×5H₂O та 6,7 г Na₂-ЕДТА розчиняють в 700 мл дистильованої води. Додають при постійному перемішуванні 200 мл 20%-ного NaOH до кінцевого об¢єму 900 мл);

3. Розчини білків невідомої концентрації (2-3 розчини).

1. Фотометричне обладнання здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 540-560 нм в діапазоні 0-1,0 од. оптичної щільності;

2. Кювети з довжиною оптичного шляху 5 мм;

3. Аналітичні ваги

4. Колба мірна ємністю 500 мл,

5. Штатив з пробірками ємністю 10 мл;

6. Піпетки місткістю 0,1; 1,0 та 5,0 мл

7. Міліметровий папір, олівець, лінійка

1. Побудова калібрувальної кривої.

Приготування маточного розчину. На аналітичних вагах зробити наважку 0,5 г ліофілізованого альбуміну, обережно перенести його в колбу і додати 4,5 мл фізіологічного розчину. Легкими обертальними рухами перемішати вміст колби до повного розчинення. Зберігати при температурі від +2 до +4⁰С.

Для побудови калібрувального графіка з основного стандартного розчину білка (1 мл основного стандартного розчину містить 0,1 г білку) готують робочі стандартні розчини, як зазначено в табл. 1.

Таблиця 1.

Приготування робочих розчинів для побудови калібрувальної кривої

Калібру-вальні точки	Кількість розчину білку, мл	Кількість 0,9% розчину NaCl, мл	Концентрація білку, г/л
	0,2	0,8
	0,4	0,6
	0,6	0,4
	0,8	0,2
	1,0

Для кожної концентрації робочого розчину роблять не менш 3 визначень. З кожного розведення беруть по 0,1 мл робочого розчину і вносять у пробірки, що містять 5,0 мл робочого розчину біуретового реактиву. Через 30-60 хв заміряють оптичну щільність проб кожної концентрації проти контролю, що містить 0,1 мл фізіологічного розчину і 5,0 мл робочого розчину біуретового реактиву. Вимірювання проводять в кюветах 5 мм та зеленому світофільтрі при 545 нм. Виміру абсорбції починають проводити з розчину меншої концентрації.

За отриманим даними будують калібрувальний графік на міліметровому папері. На осі абсцис (горизонтальній) позначають значення концентрацій, на осі ординат (вертикальній) – середні значення екстинкції для кожної концентрації білку. Через отримані точки проводять пряму лінію. Масштаб вибирають так, щоб лінія розташовувалася під кутом, близьким до 45⁰ (мал. 1).

Іноді характер графіка для більшості концентрацій білку трохи відхиляється від прямої лінії, однак якщо результати стабільно повторюються, такий графік цілком придатний для роботи.

Калібрувальну криву потрібно час від часу перевіряти. При цьому досить перевірити 2–3 точки. Якщо вони укладаються на колишньому графіку, то він не переробляється.

2. Визначення невідомих концентрацій розчинів білків

Для досліду беруть три пробірки. У 1-шу (контрольну) пробірку вносять 1 мл 0,9% розчину NaCl, у 2-гу та 3-тю (дослідні) по 0,1 мл розчинів білків невідомої концентрації. В усі три пробірки добавляють по 2 мл біуретового реактиву, обережно перемішують вміст пробірок.

Через 30 хвилин визначають екстинкцію на ФЕК розчину 2-ої та 3-ої пробірки проти контролю (1-ша пробірка) в кюветі 5 мм при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільт).

Концентрацію білка в г/л визначають по калібрувальній кривій.

Дата добавления: 2015-05-23