Хід роботи. Матеріали та обладнання

Матеріали та обладнання

Реактиви

1. А – 2%-ний розчин Na₂CO₃ в 0,10 M NaOH;

2. Б – 0,3%-ний розчин CuSO₄×5H₂O в 1%-ному розчині двузаміщеного Na- або К-тартрату;

3. В – для приготування лужного розчину міді змішують 50 мл реактиву А та 1 мл реактиву Б. Придатний для використання протягом 2 діб;

4. Г – змішують 50 мл 2%-ного розчину Na₂CO₃ з 1 мл реактиву Б. Придатний для використання 1 добу;

5. Д – реактив Фоліна-Чікольте. Після приготування використовують в той же день. Використовують готовий реактив з більш довгим терміном зберігання при 0-4⁰ С. Такий реактив перед використанням титрують аліквоту до рН 10,0 по фенолфталеїну, на основі результатів титрування розбавляють реактив приблизно в 2 рази до концентрації 1 моль/л.

6. Бичий сироватковий альбумін (БСА).

7. Суспензії білків невідомої концентрації.

1. Фотометричне обладнання здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 750 нм в діапазоні 0-1,0 одиниць оптичної щільності;

2. Кювети з довжиною оптичного шляху 5 мм;

3. Аналітичні ваги

4. Колба мірна ємністю 500 мл,

5. Штатив з пробірками ємністю 10 мл;

6. Піпетки місткістю 0,1; 1,0 та 5,0 мл

7. Міліметровий папір, олівець, лінійка

1. Побудова калібрувальної кривої.

У флакон, який містить 5 мг ліофілізованого бичого сироваткового альбуміну (БСА) або γ-глобуліну та ін., обережно додають 5 мл фізіологіч-ного розчину NaCl (концентрація маточного розчину 1мг/1мл). Потім легкими обертальними рухами перемішують до повного розчинення. Зберігати при температурі від +2 до +4 град.С.

В окремих пробірках розводять маточний розчин для побудуви калібрувальної кривої як показано в таблиці (табл.1)

Таблиця 1.

Схема розведення БСА для побудови калібрувальної кривої

Розчин БСА (мл)	Фіз.р-н (мл)	Кільк. білку (мг/мл)	Поглинання
0,025	0,975	0,025
0,05	0,950	0,05
0,1	0,9	0,1
0,2	0,8	0,2
0,3	0,7	0,3
0,4	0,6	0,4
0,5	0,5	0,5

До 1 мл білкового розчину додають 4 мл суміші розчинів А и В. Струшують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі. Потім швидко доливають 0,4 мл реактиву Фоліна, енергійно перемішують і залишають на 30-90 хв для розвитку забарвлення. Жовте забарвлення розчину поступово переходить у синє. Оптичну щільність розчину вимірюють на фотоелектро-колориметрі при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм.

За одержаними даними будують калібрувальну криву. Величину поглинання відкладають по осі ординат, а відповідну їй концентрацію білку в пробі по осі абсцис.

2. Визначення невідомих концентрацій розчинів білків

Для аналізу беруть три пробірки на 10 мл (1-ша контроль, 2-га та 3-тя розчини білків невідомої концентрації). В дослідні пробірки вносять 0,4 мл розведеного в ???? разів розчину білку невідомої концентрації, а в контрольну – 0,4 мл фізіологічного розчину або води. В обидві пробірки доливають по 2 мл реактиву В, перемішують і залишають на 10 хвилин.Потім швидко доливають 0,3 мл реактиву Д, перемішують (загальний об¢єм ????? мл), витримують 30 - 40 хв. і вимірюють поглинання проти “холостої” проби (1-ша пробірка, де замість білку прилити рівний об¢єм води або фізіологічного р-ну) при 750 нм (червоний світлофільтр), кювета 5 мм.

ΔD

0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5

Концентрація білку, мг/мл

Рис. Визначення концентрації білку по калібрувальній кривій

Вміст білку в розчинах невідомої концентрації знаходять за калібруваль-ною кривою. Для цього величину поглинання для кожної проби знаходять на осі ординат, з’єднують цю точку горизонтальною прямою з калібрувальною кривою і з точки перетину опускають перпендикуляр на вісь абсцис. Точка його перетину з віссю абсцис покаже вміст білку в пробі в мг/мл в пробі. Потім роблять розрахунок концентрації білку з урахуванням розведення.

Примітка. Інтенсивність забарвлення визначається природою білку. На розвиток забарвлення впливає наявність в розчині сахарози та тритону Х-100.

Дата добавления: 2015-05-23