Теоретичні відомості. Тема: Реакції осадження білків

Тема: Реакції осадження білків

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №5

Висновок

ЛІТЕРАТУРА

1. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия.- М.: «Просвещение».- 1987.- 815 стр.

2. Цыперович А.С. Ферменты.- К.: «Техніка».- 1971.- 358 стр.

3. Ленинджер А. Биохимия.- М.: «Мир».- 1974.- 957 стр.

4. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты (в трех томах).- М.: «Мир».- 1982.

5. Ленинджер А. Основи биохимии.- М.: “Мир”, 1985, т.1, - 365 стр.

(4 годин)

Мета: Дослідити осадження білків під дією солей амонію і важких металів, формаліну, мінеральних і органічних кислот, спиртів, нагрівання. Провести очистку яєчного глобуліну та альбуміну.

Розчинність різних речовин у одному розчиннику або речовини в різних розчинниках може коливатись у досить широких межах. Кількісно розчинність визначають вмістом речо­вини (концентрацією) у насиченому розчині. Найчас-тіше розчинність визначають кількістю грамів речовини на 100 г розчинника. Наси­чені розчини характеризуються динамічною рівновагою (при сталій температурі):

Нерозчинена речовина ↔ Речовина у розчині

У таких розчинах міститься максимальна при певній темпера­турі кількість речовини. Насичений розчин – це розчин, в якому досягнута межа насичення для певних зовнішніх умов (температури або тиску).

Якщо розчин містить менше розчиненої речовини, ніж потрібно для насичення, то такий розчин називається ненасиченим. У ненасичених розчинах межа насичення не досягну­та, але, змінюючи, наприклад, температуру розчину, можна її до­сягти.

Деякі речовини можуть утворювати так звані пересичені розчини, які при певній температурі містять більше розчиненої речовини, ніж це зумовлено межею розчинення. Такі розчини є термодинамічно нестабільними систе­мами. Вони утворюються при повільному і обережному охолодженні на­сичених розчинів деяких речовин. При внесенні у такий розчин затравки у вигляді кристала речовини, що утво­рює пересичений розчин, у осад випадає надмір цієї речо­вини у вигляді кристалів, а розчин стає насиченим (стабільним).

Концентрація розчинів це величина, яка вимірюєтья масою або об’ємом розчиненої речовини, що міститься у певній масі або об’ємі розчину або розчинника. Найчастіше використовують такі способи вираження концентрації: молярна концентрація, моляльна концентрація, нормальна концентрація еквівалента, титр.

Молярна концентрація вказує, скільки моль (грам-молекул) речовини

міститься у 1000 мл розчину. Наприклад, одномолярний (1 М), децимолярний (0,1 М) розчини містять відповідно 0,1 молі речовини у 1000 мл розчину.

Моляльна концентрація вказує, скільки моль (грам-молекул) речовини

міститься у 1000 г розчинника. Одномоляльний (1 Моляль), децимоляльний

(0,1 Моляль) розчини містять відповідно 1 та 0,1 Моль у 1000 г розчинника.

У випадку розбавлених розчинів різниця між молярністю та моляльністю незначна, тоді як у випадку концентрованих розчинів вона може бути суттєвою.

Нормальна концентрація розчину вказує, скільки грам-еквівалентів

(частин молекули, які здатні приймати участь у хімічних реакціях) речовини

міститься в 1000 мл розчину. Наприклад, 1 н. та 0,1 н. розчини містять

відповідно 1 та 0,1 г-екв. речовини у 1000 мл розчину.

Нормальна концентрація розчину вказує, скільки грам-еквівалентів (частин молекули, які здатні приймати участь у хімічних реакціях) речовини

міститься в 1000 мл розчину. Наприклад, 1 н. та 0,1 н. розчини містять

відповідно 1 та 0,1 г-екв. речовини у 1000 мл розчину.

За еквіваленти приймають для кислот – кількість іонів водню, для основ – кількість гідроксидних іонів, для солей – кількість атомів металу, помножену на їх валентність. Наприклад, для гідроксиду натрію 1 молярний розчин буде 1 нормальним (одна група ОН-), для сірчаної кислоти 1 молярний розчин буде 2 нормальним (два іони Н+), для карбонату натрію 1 молярний розчин буде 2 нормальним (валентність натрію 1 помножена на 2 атоми).

Інколи зустрічається вираження концентрації, що позначається титром. Титром ( Т ) називається кількість грамів речовини, що міститься в 1 мл

розчину.

Білки належать до незамінних речовин, без яких неможливе життя, ріст та розвиток організму. Це зумовлено фізіологічними функціями, які виконують білки в організмі людини. Найважливіші з них:

а) каталітична - найсуттєвіша, так як переважна більшість перетворень в організмі здійснюється тільки під впливом каталізаторів – ферментів, які є речовинами білкового походження;

б) структурна - на структурний білок сполучної тканини колаген припадає третина всіх білків організму за масою; структурні білки у тварин утворюють рогові покриви, є основою сполучення між клітинами;

в) рухова - скорочувальні білки у всіх живих організмів побудовані і функціонують за спільним принципом, наприклад, актин і міозин у м’язовому волокні;

г) транспортна - переносять гази (гемоглобін, міоглобін), залишки жирних кислот (альбумін крові), здійснюють активний транспорт багатьох речовин через мембрану;

д) регуляторна – регулюють швидкість біохімічних перетворень, зокрема регулюючу функцію виконують гормони гіпофізу, підшлункової залози, які є білками або похідними амінокислот, нейроолігопептиди забезпечують в головному мозку складні психічні і фізіологічні явища (пептид страху, пам’яті тощо), білки є регуляторами зчитування спадкової інформації з ДНК, рецепторами мембран, які забезпечують трансформацію і передачу в клітину інформації (гормонального сигналу);

е) захисна – деякі білки захищають організм від впливу шкідливих для життєдіяльності факторів. Основну функцію захисту у людини виконує імунна система, яка забезпечує синтез специфічних білків – антитіл у відповідь на бактерії, токсини і ін. чужорідні речовини (антигени);

є) енергетична - при повному окисненні 1 г білка виділяється приблизно 17 кДж енергії, проте білки не відкладаються про запас, а при їх розщепленні вивільняється токсичний продукт – аміак, на детоксикацію якого витрачається енергія. Половина з амінокислот, які утворюють білки, в організмі людини не синтезується і повинні поступати з їжею, тому використання білків в енергетиці є для організму вимушеним, пов’язаним із незбалансованим вмістом в їжі амінокислот, необхідних для побудови білків.

Білки це азотовмісні високомолекулярні органічні сполуки (полімери), які складаються із залишків α-амінокислот (мономери), що послідовно сполучені між собою пептидними зв’язками. Вони є найважливішими компонентами живих організмів.

Амінокислоти – похідні карбонових кислот, у яких один із гідрогенів вуглецевого ланцюга заміщений на аміногрупу (- NН₂).

Замінні амінокислоти – можуть синтезуватися в організмі людини із інших азотовмісних сполук, наприклад: гліцин, аланін, серін, пролін, тирозин, аспарагінова і глутамінова кислоти, цистин, цистеїн та ін.

Незамінні амінокислоти – не можуть синтезуватися в організмі людини. До них належать такі амінокислоти: валін, лізин, лейцин, ізолейцин, треонін, метіонін, триптофан, фенілаланін.

Дуже важливо знати, що повноцінний білок містить у своєму складі усі незамінні амінокислоти. Неповноцінний білок містить у своєму складі не усі незамінні амінокислоти. Кожен білок унікальний за своєю структурою і функціями.

Фізико-хімічні властивості білків:

- амфотерність білкових молекул – здатність проявляти кислий або основний характер.

- ізоелектрична точка білка (ІЕТ) – значення рН середовища, при якому білок не несе сумарного заряду, тобто число негативних зарядів зрівнюється з числом позитивних зарядів. У кислому середовищі сумарний заряд білкової молекули позитивний, тому вона рухається до катоду (-). У лужному середовищі сумарний заряд білкової молекули негативний, тому вона рухається до аноду(+). При значенні рН, що відповідає ізоелектричній точці, білок не рухається в електричному полі.

Кожна амінокислота, крім гліцину, містить один чи більше асиметричних атомів вуглецю, тобто проявляє оптичну активність. За абсолютною конфігурацією амінокислоти в організмі людини належать до L-ряду.

Розчинність білків – велика спорідненість з водою (гідрофільність). Це пов’язано з гідратацією білкової молекули у результаті взаємодії диполів води з йонними (-NН₂ і –СООН) і полярними (-ОН, -NН, -СО) групами в білковій молекулі. Вода навколо білкової молекули називається структурованою. Заряд білкової молекули та гідратна оболонка навколо білкової молекули надають стабільність розчинам білків. Розчинність білків у воді зростає при додаванні нейтральних солей незначної концентрації. Йони солей взаємодіють з протилежними зарядами білка, екранують заряджені групи білкових молекул і тим самим зменшують білкову взаємодію. Зворотну дію здійснює підвищення концентрації солей.

Висолювання – процес осадження білка нейтральними солями. При цьому руйнується гідратна оболонка і нейтралізуються заряди білкової молекули. Такі білки зберігають свої природні властивості і функції після видалення солі.

Емульгуючі властивості білка – білок утворює на поверхні крапель жиру (за рахунок гідрофобної взаємодії) тонку плівку, яка притягує воду (за рахунок полярних груп) і протидіє злипанню жирових часток. Казеїн молока емульгує (стабілізує) природну емульсію – молоко.

Денатурація – під дією різних фізичних і хімічних факторів порушується природна просторова структура білкової молекули: руйнуються четвертинна, третинна і вторинна структури (первинна не змінюється). Це призводить до зменшення або повної втрати розчинності, специфічної біологічної активності, зміни оптичних властивостей, в’язкості та ін.

При денатурації розриваються йонні, водневі і дисульфідні зв’язки, поліпептидний ланцюг розкручується і знаходиться або в розгорнутому стані, або у вигляді хаотичного клубка. Для більшості білків це незворотний процес, але для деяких, наприклад, білків м'язів – зворотний.

Реакції осадження білків дуже різні, їх можна розділити на дві групи:

а) практично незворотні реакції осадження, при яких білки зазнають глибокі зміни і не можуть бути знов розчинені в первинному розчиннику: в цьому випадку має місце денатурація білка; до необоротних реакцій відносяться осадження білку солями важких металів, алкалоїдними реактивами, мінеральними, органічними кислотами і осадження при нагріванні;

б) зворотні реакції осадження, при яких білки, не піддаються глибоким змінам і тому можуть бути розчинені в первинному розчиннику; молекули білка при цьому зберігають свої первинні, включаючи біологічні, властивості і не піддається денатурація.

До зворотних реакцій осадження слід віднести реакції осадження білків органічними розчинниками (спиртом або ацетоном) і реакції висолювання білків (осадження під впливом концентрованих розчинів нейтральних солей лужних і лужноземельних матеріалів).

Осадження білків при нагріванні

Майже всі білки денатурують при нагріванні при температури від 50⁰С до 55⁰С і вище. Механізм теплової денатурації пов'язаний з перебудовою структури білкової молекули, в результаті якої білок втрачає свої нативні властивості і розчинність. Присутність солей і концентрація водневих йонів відіграють важливу роль у випаданні в осад денатурованого при нагріванні білку. Якнайповніше осадження відбувається в ізоелектричній точці білка, тобто при такій величині рН, коли колоїдні частинки білка найменш стійкі.

Осадження білку концентрованими мінеральними кислотами

Осадження білку концентрованими мінеральними кислотами (окрім ортофосфорної кислоти) пояснюється як явищами дегідратації білкових частинок і нейтралізації їх зарядів, так і з інших причин (денатурацією, утворенням солей).

У надлишку сульфатної або хлоридної кислот, а також при їх тривалій дії, осад денатурованого білку розчиняється, за рахунок перезарядки білку і часткового гідролізу. У надлишку нітратної кислоти цього розчинення не відбувається (супутній нітрат-йон заважає перезарядці білкової молекули).

Осадження білку органіними кислотами

Механізм осадження білків органічними кислотами пояснюється дегідратацією білкової молекули і зняттям заряду. Осадження трихлороцтовою кислотою надає можливість відокремити білки від пептидів та амінокислот (білковий азот відділяється від небілкового). Відбувається незворотна реакція осадження.

Осадження білку солями важких металів

При дії солей важких металів (солі Pb, Cu, Zn, Ni, Cd, Co, Sb, Sn, Bi, Hg та ін.) на розчини білку відбувається денатурація білкової молекули. Осадження дегідратованого білку обумовлене адсорбцією важкого металу на поверхні білкової молекули і утворенням нерозчинних комплексів. Надлишок деяких солей веде до розчинення (пептизації) осаду білків. Такий спосіб осадження надає можливість виділяти білки для дослідження їх біологічної активності.

Висолювання білків амоній сульфатом

Розділення білків проводиться методом висолювання. Висолюванням називається процес осадження білків з їх водних розчинів нейтральними розчинами концентрованих солей лужних та лужноземельних металів: натрій сульфатом, амоній сульфатом, магній сульфатом, натрій хлоридом і т.д. При додаванні досить великих кількостей цих солей до розчину білка відбувається дегідратація білкової молекули і нейтралізація заряду.

Для розділення білків методом висолювання широко використовується амоній сульфат. Глобуліни випадають в осад в напівнасиченому розчині солей, альбуміни - в насиченому. Концентрацію окремих фракцій білків визначають колориметрично по інтенсивності біуретової реакції.

Висолювання білків є зворотним процесом: після виведення солі шляхом

діалізу або розведенням водою білок знову розчиняється і володіє нативними

властивостями.

Це можна пояснити наступним чином: у водному розчині молекули білків заряджені і гідратовані. Молекули солей руйнують гідратну оболонку і знімають заряд з білкової молекули шляхом адсорбування на ній йонів солей. Внаслідок цього молекули білків злипаються і випадають в осад. Для різних солей потрібне різне значення рН середовища для висолювання білків. Так, амоній сульфат висолює білки у слабкокислому середовищі.

Самостійна робота студентів

1. Відділити білки курячих яєць.

2. Виміряти об’єм білку.

3. Додати насичений розчин сульфату амонію.

4. Відфільтрувати глобуліни, що випали в осад.

5. Одержати частину відфільтрованого розчину білку та виміряти його об’єм.

6. Додати дорозчину білку розтертий порошок солі амонію.

7. Одержати осад альбуміну.

8. Виміряти концентрацію глобуліну та альбуміну в розведених розчинах білків.

9. Вирахувати одержані концентрації глобуліну та альбуміну.

10. Написати висновок.

Дата добавления: 2015-05-23