Практичне заняття №2

Тема: «Фарбування бактерій за Грамом»

1. Актуальність теми:

Метод фарбування бактерій за Грамом відноситься до складних методів. Складні методи застосовують для детального вивчення структури бактеріальних клітин, а також для диференціації одних мікроорганізмів від інших. Отже, вони мають важливе диференційно-діагностичне значення в мікробіології. Серед складних методів фарбування метод Грама є найбільш поширеним. При фарбуванні бактерій цим методом їх можна поділити на дві групи: грамнегативні та грапозитивні. Особливості фарбування за Грамом враховуються, поряд з іншими властивостями, при визначенні виду бактерій.

2. Конкретні цілі:

· Засвоїти техніку фарбування за Грамом, використовуючи культури грампозитивних та грамнегативних бактерій.

· Вивчити властивості грампозитивних та грамнегативних бактерій.

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №1.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення
Складні методи фарбування бактерій	Складні методи дозволяють диференціювати одні мікроорганізми від інших, а також вивчити особливості будови мікробних клітин. До складних методів відносять фарбування за Грамом, за Романовським-Гімзою, методом Циля-Нільсена, Нейсера.
Метод Грама	Метод розробив Крістіан Грам у 1884р.Серед складних методів фарбування він є найбільш поширеним. Він має важливе диференційно-діагностичне значення, оскільки допомагає визначити таксономічне положення тих чи інших бактерій
Тинкторіальні властивості бактерій	Особливість забарвлення бактерій тими чи іншими методами називають їх тинкторіальними властивостями.
Грампозитивні бактерії	Грампозитивні бактерії забарвлюються за методом Грама в темно-фіолетовий колір (здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом).
Грамнегативні бактерії	Грамнегативні бактерії забарвлюються за методом Грама в червоний колір (сполука з генціанвіолетом та йодом вимивається спиртом, тому вони забарвлюються фуксином в червоний колір).

4.2. Теоретичні питання до заняття:

· Складні методи фарбування бактерій.

· Метод Грама.

· Механізм фарбування за Грамом.

· Методика фарбування за Грамом.

· Властивості грампозитивних та грамнегативних бактерій.

· Тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

· Вивчити властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів.

· Записати тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів.

· Вивчити фактори, що впливають на фарбування за Грамом.

· Вивчити особливості хімічного складу клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій.

· Приготувати препарати-мазки з чистих культур бактерій, пофарбувати за методом Грама, дослідити в мікроскопі, визначити морфологічні та тинкторіальні властикості.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти вивчають методику фарбування за Грамом, готують мазки із чистих культур стафілокока та кишкової палички, фарбують мазки за методом Грама, вивчають виготовлені препарати із використанням імерсійного об’єктиву, властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

Рекомендації для оформлення протоколу.

ВЛАСТИВОСТІ ГРАМПОЗИТИВНИХ ТА ГРАМНЕГАТИВНИХ МІКРООРГАНІЗМІВ

ГРАМПОЗИТИВНІ	ГРАМНЕГАТИВНІ
Не чутливі до дії пепсину, трипсину, панкреатину.	Перетравлюються ферментами шлунково-кишкового тракту.
Чутливі до лізоциму, пеніциліну.	Мало чутливі.
Слабо виражені імуногенні властивості.	Добре виражені імуногенні властивості.
Можуть бути кислотостійкими.	Чутливі до дії кислот.
Можуть утворювати ендоспори.	Ендоспор не утворюють.
Війок не утворюють.	Можуть утворювати війки.
Можуть утворювати екзотоксин.	Рідко продукують екзотоксин. При руйнуванні клітин виділяється ендотоксин.

Оболонка бактеріальної клітини

1.Цитоплазматична мембрана (ЦПМ).

2.Периплазматичний простір.

3. Клітинна стінка.

4. Пептидоглікан (багатошаровий), тейхоєві кислоти.

5. Пептидоглікан (одношаровий).

6. Зовнішня мембрана (подвійний шар фосфоліпідів).

7. Ліпопротеїни.

8. Білки-поріни.

9. Ліпополісахарид.

10. Слизовий шар

ТИНКТОРІАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ДЕЯКИХ МІКРООРГАНІЗМІВ

ГРАМПОЗИТИВНІ	ГРАМНЕГАТИВНІ
1. Стафілокок. 2. Стрептокок. 3. Коринебактерії дифтерії. 4. Мікобактерії туберкульозу. 5. Збудник правця. 6. Збудник газової гангрени. 7. Збудник ботулізму. 8. Актиноміцети.	1. Менінгококи. 2. Гонококи. 3. Кишкова паличка. 4.Сальмонели. 5. Шигели. 6. Збудник чуми. 7. Збудник туляремії. 8. Холерний вібріон.

ФАКТОРИ, ЩО ВПЛИВАЮТЬ НА ФАРБУВАННЯ БАКТЕРІЙ ЗА ГРАМОМ

1. Клітинна стінка грампозитивних бактерій містить до 90% пептидоглікану (глікопептиду, муреїну), містить тейхоєві кислоти. Муреїн багатошаровий. У грампозитивних бактерій, проникність клітинної стінки нижча, ніж у грамнегативних бактерій. Комплекс генціанвіолет-йод утримується в стінці після дії спирту, оскільки при цьому зменшується діаметр пор в глікопептиді. Стінка грамнегативних бактерій містить глікопептиду значно менше, його молекула “зшита” слабкіше порівняно з стінкою грампозитивних бактерій. Вважають, що після обробки етиловим спиртом пори в молекулі глікопептиду грамнегативних бактерій залишаються широкими, що дозволяє екстрагувати комплекс генціанвіолет-йод.

2. У грампозитивних бактерій виявлено велику кількість рибонуклеїнату магнію (співвідношення РНК:ДНК у грампозитивних бактерій дорівнює 8:1, а у грамнегативних бактерій 1:1). Вважають, що рибонуклеїнат магнію утворює великі стійкі комплекси з барвником і йодом, які не вимиває спирт.

3. Відмінність в кислотності білків цитоплазми у грампозитивних та грамнегативних бактерій. Ізоелектрична точка білків цитоплазми грампозитивних бактерій знаходиться в межах рН 4-5, у грамнегативних бактерій – в межах рН 5-6. Кислі білки грампозитивних бактерій мають спорідненість до основних анілінових барвників, утворюють з йодом та генціанвіолетом більш стійкі до дії спирту комплекси.

ОСОБЛИВОСТІ ХІМІЧНОГО СКЛАДУ КЛІТИННОЇ СТІНКИ ГРАМПОЗИТИВНИХ ТА ГРАМНЕГАТИВНИХ БАКТЕРІЙ

ГРАМПОЗИТИВНІ	ГРАМНЕГАТИВНІ
1.У клітинній стінці мало білків, а пептиди одноманітні за складом амінокислот.	Клітинна стінка містить усі амінокислоти, містить білки.
2. Ліпідів мало.	Ліпідів багато (до 22%).
3. Пептидоглікану до 90%.	Пептидоглікану мало (5-9%).
4. Містять тейхоєві кислоти.	Тейхоєві кислоти відсутні.

СТРУКТУРНІ ОСОБЛИВОСТІ КЛІТИННИХ СТІНОК

ГРАМПОЗИТИВНІ	ГРАМНЕГАТИВНІ
1. Просто побудована клітинна стінка	1. Клітинна стінка має складну структуру.
2. Клітинна стінка складається з пептилоглікану. Товщина клітинної стінки 100-500А.	2. Клітинна стінка багатошарова: внутрішній- глікопептид; середній- фосфоліпіди, ліпопротеїни, білки; зовнішній- ліпополісахариди.
3. Пептилоглікан багатошаровий	3. Один шар муреїну.
4. Матрикс представлений полісахаридами (в тому числі тейхоєві кислоти)	4. На пептилоглікановому каркасі зовні розміщуються ліпопротеїди, ліпополісахариди, фосфоліпіди. Тейхоєві кислоти не виявлені.

Методика фарбування за Грамом.

1. На фіксований мазок наносять розчин генціанвіолету на 1-2 хв., після чого розчин зливають, не змиваючи його водою.

2. Наносять на мазок розчин Люголя на 1-2 хв.

3. Знебарвлюють мазок 96% спиртом протягом 15-20 сек.

4. Промивають водою.

5. Наносять на мазок розчин фуксину на 1-2 хв.

6. Промивають водою, висушують фільтрувальним папірцем.

Завдання 1. Приготувати бактеріальні препарати із коків, паличок та їх суміші, пофарбувати за Грамом, встановити морфологічні та тинкторіальні властивості.

Чиста культура Чиста культура

Staphylococcus Escherichia coli

saprophyticus

Фарбування за Грамом

Висновок:

6. Питання для самоконтролю:

· Методика фарбування за Грамом;

· Чому метод Грама називають диференційним?

· Які особливості хімічного складу клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій?

· Які особливості будови клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій?

· Назвіть основні фактори, що впливають на забарвлення бактерій за Грамом.

Дата добавления: 2015-06-25