Культивування клітин. Історія методу

Продукт Клітини або їхнє джерело

Гормон росту Пухлина гіпофізу

Колаген Фібробласти

Кортикостероїди Пухлина наднирників

Гістамін Пухлина із гладких клітин

Меланін Меланома райдужної оболонкисітківки

Мукополісахариди Фібробласти

Фактор росту нервової тканини Нейробластома

Важливий напрямок клітинної інженерії пов'язаний з ранніми ембріональними стадіями. Так, запліднення яйцеклітин у пробірці дозволяє перебороти безпліддя. За допомогою ін'єкції гормонів можна одержати від однієї тварини десятки яйцеклітин, штучно їх запліднити іп vitro і імплантувати до матки інших тварин. Ця технологія застосовується у тваринництві для одержання монозиготних близнюків. Розроблено новий метод, заснований на здатності індивідуальних клітин раннього ембріона розвиватися в нормальний плід. Клітини ембріона поділяють на кілька рівних

частин і трансплантують реципієнтам. Це дозволяє розмножувати тварин прискореним шляхом. Маніпуляції на ембріонах використовують для створення ембріонів різних тварин. Підхід дозволяє перебороти міжвидовий бар'єр і створювати химерних тварин. У такий спосіб отримані, наприклад, вівце-цапині химери.

Ідея про можливості культивування клітин поза організмом уперше була висловлена наприкінці минулого століття, але перші культури клітин отримали на початку нашого століття, і ними виявилися, як не дивно, клітини тварин, а не рослин. А культивування рослинних клітин на штучних поживних середовищах довгий час не вдавалося. І лише у 30-і роки були досягнуті перші успіхи в цій галузі, які й забезпечили бурхливий розвиток даного напрямку.

Визнання ідеї про те, що клітини тканин вищих тварин можна виділити з організму і потім створити умови для їх росту та відтворення іп vitro, датується першим десятиліттям XXст. Після того як стало відомо, що подібні процеси реальні, настав другий етап робіт, початок якому поклала демонстрація можливості вирощування й репродукції в таких клітинах фільтрівних інфекційних агентів-вірусів. Третій етап історії починається відтоді як була показана практична можливість одержання в клітинах тварин значної кількості вірусного матеріалу для застосування у вакцинних препаратах, і триває до часу, коли:

1) стало можливим вбудувати в клітини специфічні екзогенно отримані гени, що здатні до експресії;

2)було підтверджено можливість вирощування в культурі з поодинокої клітини цілої популяції.

Коли такі популяції отримували із клітини, що виділяла в навколишнє середовище антитіла, всі молекули антитіл у над осадовій рідині були однаковими. Причини й наслідки цих двох феноменів у наш час інтенсивно досліджуються, й вони знаменують собою початок четвертого етапу робіт у даній галузі.

Щоб показати здатність клітин тварин рости і розподілятися в культурі, необхідно було опанувати ряд підходів і методик:

1. Методики одержання клітин, вільних від екзогенних прокаріотів

і грибів;

2. Методики розроблення середовищ, у яких ріст «вирізаних із тканини» або ізольованих клітин не гальмується;

3. Методики спостереження за клітинами в динаміці їхнього розвитку;

4. Методики безперервного культивування культур клітин тварин іп vitro і підтримки їх вільними від інших біологічних агентів.

Науковою основою для розроблення цих методик стає уявлення про клітину як основний структурний елемент живих організмів тваринного й рослинного походження. Ідея про те, що клітини тканин тварин можна виділити з організму і потім створити умови для росту й відтворення їх іп vitro виникла на базі концепції, що належить Клоду Бернару. Він припустив, що не тільки живі організми здатні зберігати сталість внутрішніх умов поза залежністю від змін у навколишньому середовищі. Клітина поза організмом тварини теж буде прагнути підтримувати свої внутрішні умови. Якщо різниці між внутрішніми й зовнішніми умовами будуть незначними, то існує висока ймовірність росту і подвоєння клітини. Таке розуміння явища приводить до необхідності розробки середовищ, здатних підтримувати й стимулювати ріст клітин поза організмом.

Дещо пізніше, у 1885 році, У. Ру (W. Rоих) показав можливість збереження поза організмом живих тканин на практиці. Він зберігав у життєздатному стані оболонку курячого ембріона в теплому фізіологічному розчині. Згодом він став автором, який активно публікувався із проблем ембріології іп vitro. У 1897 р., Леб Ж. (LоеЬ. J) підтримував у життєздатному стані клітини крові й сполучної тканини в пробірках із сироваткою і плазмою крові. І. Льюнгрен (1898) показав можливість підтримки експлантатів шкіри людини у життєздатному стані в кислому середовищі зі збереженням здатності до реімплантації. Додаткові експерименти були проведені Р. Джоллі (1903), який спостерігав подвоєння клітини у висячій краплі, що містила лейкоцити саламандри, а В. Біб і К. Евінг (1906) підтвердили це за пересадження лімфосаркомної тканини собаки.

Продовжуючи роботи У. Ру, Р. Харрисон удосконалив методику «висячої краплі». Він використав невеликі шматочки тканини, що були відірвані від медулярної судини жаби і впроваджені до її лімфатичного тромбу, і витримував їх у вигляді краплі на нижній стороні покривного скла, розташованого поверх поглиблення на предметному склі. У 1907 р. йому вдалося спостерігати за допомогою такої «камери» ріст нервових клітин протягом декількох тижнів; вінустановив, що швидкість росту цих клітин становить 20 мкм за 25 хв. У той час як експерименти Харрисона були спрямовані на те, щоб одержати відповіді на питання, що ставляться до фізіології нервових клітин жаби, методика, якою він користувався, була застосована К. Барроузом для інших клітин тканин теплокровних тварин. Цей дослідник у 1910 р. замість лімфатичного тромбу використав тромб плазми курки.

У 1913 р. Алексіс Каррель застосував плазму крові, збагачену екстрактом ембріона. Добавка такого екстракту прискорювала ріст тканин. Використана методика забезпечувала значно більшу ймовірність успіху, ніж та, що використовували С.А. Левіс (1911) і Л.М. Рід (1908). Рід готувала культури клітин з кісткового мозку морської свинки й намагалася вирощувати експлантати на середовищі певного хімічного складу. Робота Карреля привернула велику увагу, тому що вона була опублікована під назвою, що інтригує, −«Культивування «безсмертних» клітин». Інкубація клітин серця ембріона курки була розпочата 17 січня 1912 р. Пересівання клітин продовжив Еблінг, працюючи з ними 34 роки, як він сам заявляв. Оскільки Каррель був хірургом і досить компетентним з питань асептики, він зміг зробити істотний внесок у культивування клітин тварин іп vitro. У той же час організація і технічні умови проведених експериментів були дуже громіздкими. Асистенти Карреля були одягнені в довгополі гумові халати темного кольору з каптурами для повного прикриття голови. Процедури були тривалими й обтяженими багатьма деталями. У результаті тих вимог, що висувалися автором стосовно складних заходів обережності для запобігання контамінації (від лат. сопtатіпаtio змішання), навколо даного предмета створилася атмосфера таємничості і винятковості, що гальмувало прогрес, а не сприяло йому. Проте ним було досягнуто багато чого. Зокрема, навіть за відсутності антибіотиків він досяг успіху в пересадженні клітин, використовуючи хірургічну техніку для відторгнення окремих колоній і перенесення їх у нові умови росту. Каррель також продемонстрував своїм колегам наукове значення тих спостережень, що можуть бути зроблені в процесі пересадження клітин.

У ході здійснених робіт було внесено ряд виправлень у рецептуру середовища культивування. Зокрема, М. Тірод модифікував розчин Рінгера й на додаток до курячої сироватки і ембріонального екстракту почав використовувати коагулят фібрину.Для спостереження за клітинами тварин, що поділяються, Канті у 1928 р. розробив метод кінофотомікрографії. У цей же період було розроблено додатковий і дуже істотний підхід до техніки роботи із клітинами. Мається на увазі застосування трипсину для вивільнення клітин з тканинної матриці, в якій вони знаходяться. Однак, ця методика не дістала визнання доти, поки у 1937 р. X. Сіммс і Дж. Стідлман використали її для пасирування клітин між культурами плазми. Ця методика дає можливість успішно застосовувати в культурах індивідуальні клітини, а не тканини.

Уперше клони клітин у культурі з одиночної клітини були отримані Ерлом В. зі співробітниками у 1948 році. Ігл Г.М. (1955) систематично досліджував харчові потреби клітин в спеціальних умовах. Вважалося, що стала один раз клітинна лінія має необмежений час життя, поки у 1961 р. Л. Хейфлік та П. Мурхед не виділили лінію диплоїдних клітин людини (НДС) WI-38. Щодо лінії WI-38 було показано, що період її існування в культурі обмежується близько 50 подвоюваннями популяції. Перед відмиранням популяції для клітин цієї лінії характерний феномен старіння. Однак, за відмирання ці клітини залишалися диплоїдними і не мали ознак злоякісних змін. Клітини, виділені з ракових пухлин або трансформовані в ході культивування, характеризуються «безсмертністю» і корелюють із гетероплоїдністю. Перші суспензійні культури клітин тварин, як правило, ґрунтувалися на клітинах злоякісних тканин. Це − клітини Неlа, виділені з ракової пухлини шийки матки людини. Лінія карциноми шейки матки, що перевивається, була виділена ще у 1952 році Г.С. Джеєм зі співробітниками, вона використовується й у цей час у багатьох лабораторіях світу.

Наступний етап в історії культивування диплоїдних клітин людини пов'язаний із установленням факту, що вони є генетично стабільними й вільними від усіх відомих латентних і онкогенних вірусів. Тому лінії диплоїдних клітин людини дозволено застосовувати для одержання продуктів, що призначаються для людей. Ця догма залишається діючою і у наш час, хоча новітні відкриття чітко показали присутність у клітинах, виділених з нормальних тканин, потенційних онкогенів, ідентичних тим, ще знайдені в таких відомих онкогенних вірусах, як вірус саркоми Рауса і вірус саркоми Молоні. Раус П. ще у 1910 році індукував пухлину, використавши профільтрований екстракт курячої пухлини. Ця пухлина була індукована РНК-вірусом (вірус саркоми Рауса), Пізніше встановили, що ряд вірусів здатні індукувати виникнення пухлин, такі віруси називаються онкогенними.

Дата добавления: 2017-02-01