Системи культивування клітин

Усі способи вирощування клітин тварин можуть бути співвіднесені або до інтактних (нетрансформованих за допомогою вірусів), або до вірусотрансформованих клітин. Успіх культивування перших багато в чому обумовлений наявністю й щільністю адгезинів, завдяки яким вони проявляють ефект «розпластування» на поверхні скла, металу або пластику. Однак, такі клітини не ростуть у суспензійних культурах.

Вірусотрансформовані клітини тварин, навпаки, добре ростуть у вигляді суспензійних культур і гірше або зовсім не ростуть в адгезированому стані. Є такі штами тваринних клітин, які можуть рости й у прикріпленому стані, і у вигляді суспензії клітин, що прикріпилися, розмножуються, ростуть і розвиваються, поки не зіллються в моношар, тобто щільність клітин є гальмівним сигналом. Однак, за зміни поживного середовища на нові порції спостерігається подальше розростання клітин у формі декількох шарів, що злилися. Подібного результату можна домогтися за використання інших факторів впливу на клітинні культури (гормони, ферменти, рН і т.ін.). Проте, на практиці широко користуються моношаровими культурами.

Є дві основні системи культивування клітин:

1. Непротічні культури −тип культур, у якому клітини вводять у фіксований об'єм середовища. У міру росту клітин відбувається використання поживних речовин і накопичення метаболітів, тому середовище повинно періодично змінюватися, що призводить до зміни клітинного метаболізму, називаного ще і фізіологічною диференціацією. Згодом, у наслідок виснаження середовища відбувається припинення проліферації клітин.

Збільшити тривалість життя непротічних культур можна декількома способами:

− переривчастий (частина культури замінюється рівним об'ємом

свіжого середовища);

− постійний (об'єм культури збільшується з постійно низькою швидкістю, а невеликі порції клітин періодично віддаляються);

− перфузійний (здійснюється постійне надходження свіжого середовища до культури й одночасне видалення рівного об'єму використаного (безклітинного) середовища.

Перфузія може бути відкритою, коли із системи віддаляється все середовище, і закритою, коли середовище, що видаляється, проходить через додаткову судину, де відновлюється його рН і здійснюється аерація, а далі повертається до культуральної судини.

Усі системи непротічних культур характеризуються накопиченням відходів у тій або іншій формі й мінливістю зовнішніх умов.

2. Протічні культури забезпечують дійсні гомеостатичні умови без зміни концентрації поживних речовин і метаболітів, а також числа клітин. Гомеостаз обумовлений постійним надходженням середовища до культури й одночасним видаленням рівного об'єму середовища із клітинами. Такі системи придатні для суспензійних культур і моношарових культур на мікроносіях.

Існує два великих напрямки в культивуванні тваринних клітин: моношарові культури й суспензійні культури.

Глибинне вирощування клітину моношарі. Ріст клітин у вигляді моношару залежить від адгезивних білків − фібронектинів (від лат. fibra − нитка, песtеrе − зв'язувати або з'єднувати), що забезпечують міжклітинну адгезію, прикріплення клітин до підкладки і спрямовують їх переміщення. У тваринному організмі клітини, здатні до переміщень (особливо в період ембріонального розвитку, при загоєнні ран), і пов'язані з базальними мембранами, містять на своїй поверхні великомолекулярні глікопротеїнові молекули фібронектину, відкритого у 1973 р. Р.О. Хайнсом (Англія), К. Гамбергом і С.І. Хакоморі (СПІА) при вивченні нормальних і пухлинних клітин. Фібронектин під час полімеризації утворює довгі нитки навколо клітин, що контактують із клітинною мембраною і зв'язуються із цитоскелетним білком-актином.

Молекула фібронектина складається із двох субодиниць з молекулярною масою близько 250 кДа, які містять невеликі за розмірами домени, що з'єднані на одному кінці двома 8-8-містками. Розміри однієї субодиниці 60...70 х 2-3 нм; на цю довжину припадає від 2145 до 2445 залишків амінокислот. Кожен домен відповідає за одну функцію фібронектину, наприклад, за з'єднання з фібрином,інший домен − за прикріплення до пластика й т.ін.

Доведено, що фібронектин є у всіх представників царства Апітаliа. Амфотерний глікопротеїнфібронектин в ізольованому вигляді стимулює адгезію, якщо додавати його до поживного середовища в концентрації близько 1... 5 мкг/мол. Амфоліт у цьому разі є містком між негативно зарядженою поверхнею тваринної клітини й субстратом, що несе негативний або позитивний заряд. Вільна енергія поверхні твердого носія може бути високою (чисті поверхні скла, металів, металевих окислів) або низькою (поверхні з органічних полімерів), хоча зрозуміло, що за відповідних обробок низькоенергетичні поверхні трансформуються у високоенергетичні. Як сполучні містки можливо застосовувати йони кальцію або магнію.

Поряд із щільністю заряду в здатності клітин до прикріплення велике значення мають характеристики субстрату: гідрофільність його поверхні (змочуваність), довжина й горизонтальність. Розпластуваність клітин на підкладці стане вищою, якщо кількість негативних зарядів буде не нижче 5 на площі 10 нм. Адгезивні властивості більше виражені для поверхонь, що змочуються, порівняно з гідрофобними, за довжиною вони повинні бути більше нормальної довжини клітин; субстрати зі скривленою поверхнею гірші за гладкі − зростаючі клітини поширюються в напрямку найменшої кривизни субстрату. Якщо, наприклад, прикріплення клітин до агар-агару прийняти за одиницю, то до тефлону вони прикріплюються в 5 разів швидше, до поліетилену − в 8 разів, до поліпропілену − в 9 разів, до гуми − в 12 разів, до алюмінію − в 15 разів, до скла − в 16 разів, а до сталі й полістирену − в 20 разів.

Великомасштабне культивування тваринних клітин у моношарі націлене на одержання найбільшої концентрації клітин у найменшому об'ємі газової фази. Вибір клітин не настільки великий, але деякі з них повністю адаптовані до умов вирощування іп vitro. У 1964 р. уперше були отримано лінії сполученотканих клітин − фібробластів ВНК 21 від сірійського хом'яка. Ці клітини пасируються необмежено довго і спочатку використовувалися для репродукції вірусу ящура за приготування відповідних вакцин.

Варто мати на увазі, що нормальні диплоїдні клітини людини, наприклад, лінії WI -38, можуть поділятися обмежену кількість разів (50±10) і виявляють феномен старіння. У той же час такі клітини, як Неlа, виділені з ракової пухлини шийки матки людини, виявилися безсмертними при пасеруванні. За доступності донорської тканинивикористовують клітини нирок кролів, мавп, собак (лінія МДСР), 10...14-денних ембріонів курей, клітини з мигдалин, амніону, легенів ембріона людини 12...16-тижневого віку, клітини епідермісу дорослої людини, фібробласти мишей (лінія LS), диплоїдні фібробласти людини (лінія МRС-5) та інші.

Обрані клітини вирощують у суворо асептичних умовах, застосовуючи спеціальне устаткування під час повільного обертання ролерної системи або погойдування для омивання більшої площі культурального середовища. Клітини почергово занурюються у рідку та в газоподібну фазу. При цьому з надлишком забезпечуються їхні дихальні потреби киснем.

Під час циклу культивування клітин слід враховувати різні параметри. Одні з них належать до числа константних, інші − до числа варіабельних. Константними є якість матеріалу, форма й обсяг культиватора, варіабельними − швидкість обертання або погойдування, якість і обсяг середовища, тип клітин і розмір (величина) посівного матеріалу, рН і температура середовища, постачання кисню і вміст С0₂ у культиваторі, окислювально-відновний потенціал і концентрація основних джерел живлення. Перші три варіабельних показники можна підтримувати постійними, переводячи їх у розряд константних.

Контроль за розвитком клітин здійснюють за допомогою прямих (підрахунок) і непрямих методів (за каламутністю, підрахунком ядер, визначенням загального білка).

Посівний матеріал (інокулят, від лат. іпосиlаtіо − щеплення) помітно позначається на швидкості росту клітин у моношаровій культурі. У разі застосування первинних клітин необхідно мати їх у більш високій щільності на 1 см² внутрішньої (робочої) поверхні культиватора.

Якщо ж використовують клітинні лінії (а не первинні клітини), то щільність інокуляту може бути трохи меншою, тому що вони, майже всі 100%, здатні до адгезії на поверхні культиватора. Погойдування або клітин, що омиваються середовищем, безсумнівно позначається на їхньому прикріпленні.

Моношарові культури також мають ряд переваг:

1. Легко можна провести повну заміну середовища і промити

клітини перед додаванням свіжого поживного середовища. Цеважливо в тих випадках, коли ріст клітин відбувається в однихумовах, авироблення продукту в інших умовах, наприклад, заперенесення клітин із середовища з сироваткою в безсироваткове середовище. Можна також повністю видаляти небажані компоненти.

2. Дозволяють забезпечити високу щільність клітин.

3. У багатьох клітин експресія необхідного продукту відбувається більш ефективно, якщо клітини прикріплені до субстрату.

4. Моношарові культури можуть бути використані для будь-якого типу клітин, що забезпечує найбільшу гнучкість досліджень.

5. У деяких випадках, наприклад, для розповсюдження вірусів, потрібні тісні міжклітинні контакти.

Недоліками моношарових культур є:

− потреба великого простору;

− зростання вартості й трудомісткості за збільшення масштабу;

− недостатньо ефективний контроль, обумовлений труднощами відбору проби;

− труднощі у визначенні й контролюванні рН, концентрації кисню.

Слід зазначити, що застосування мікроносіїв усуває ці недоліки. Існує кілька різних різновидів цього способу культивування.

1. Культивування в плоских флаконах (матрацах).

2. Культивування в обертових суліях, коли в кожний момент часу 15...20% поверхні сулії покрито поживним середовищем, а клітини перебувають перемінно то в середовищі, то в повітрі.

3. Культивування в колонках на мікроносіях, якими є щільно впаковані скляні намиста, що не зміщуються, діаметром 35 мм, стопка пластин й ін., а поживне середовище обмиває їх, протікаючи зверху вниз.

Глибинне вирощування клітин у суспензійних культурах. Площу вирощуваних клітин можна істотно збільшити, використовуючи мікроносії, що створюють суспензію у поживному середовищі, й на поверхні яких клітини закріплюються, а потім розростаються у вигляді моношару. Такі суспензійні мікроносії із клітинами моделюють глибинні культури, наприклад, мікроорганізмів. Отже, у таких системах сполучаються моношарові й суспензійні культури тваринних клітин.

Як мікроносії застосовують позитивно заряджені ДЕАЕ-сефадекси, сефадекси з колагеновим покриттям, негативно заряджений полістирол, порожні скляні сфери й ін. Так, наприклад, окремі фірми пропонують мікросфери з пористого жужільного скла, які можуть бути використані для іммобілізації клітин ссавців. Пори їх доступні для пенетрації (від лат. репеtrtіо− проникнення) клітин усередину матрикса. Пористі сфери придатні для іммобілізації суспензійних клітин, що прилипають (наприклад, гібридом).

Необхідна кількість їх приблизно дорівнює 10 /мл, а для інокуляції необхідно до 10⁵ клітин. За збільшення кількості мікроносія зростає доза клітин в інокуляті (рис. 45).

Рис. 45. Мікросфери для іммобілізації клітин ссавців з

мікропористих, біологічно інертного скла - (а)

і склашлаку (так званий Cultispher-G) - (б);

(збільшення х 10000)

Підхід до вибору середовищ і контрольованого параметра культивування залишається тим самим. Клітини після вирощування відокремлюють від мікроносіїв центрифугуванням (у тому числі − у градієнті щільності), фільтруванням, або, частіше, обробкою трипсином з наступним промиванням і сепаруванням.

Суспензійні клітини на мікроносіях застосовують із метою одержання вірусних вакцин (проти сказу, поліомієліту, ящура).

Можливості перенесення генетичної інформації з еукаріотичних клітин у прокаріотичні зняли проблему масового культивування тваринних клітин для одержання таких продуктів, як інтерферон, гормони, лімфокіни й інших. Тут успішно розвивається рДНК-біотехнологія. Клітинам тварин у глибинних культурах майже у всіх випадках необхідна захисна матриця, функцію якої беруть на себе білки сироватки крові, що додають до середовища культивування. Цим ще раз підтверджується більш висока травмованість клітин тварин порівняно з мікробними й рослинними клітинами. Проте, основні підходи до вибору обладнання й реалізації біотехнологічних процесів з використанням тваринних клітин багато в чому аналогічні з такими в мікробній біотехнології. Наприклад, системи культивування в обох випадках можуть бути хемостатичними, циклічними, безперервними або напівбезперервними.

На противагу суспензійним культурам клітин на мікроносіях розроблено способи інкапсулювання їх у полімерні сфери (полілізинові, агарозні, з полімерних смол), коли клітини не зазнають тієї механічної напруги, що вони повинні виявляти у вільному вигляді. Ці способи стали вигідними для культивування гібридом з метою одержання моноклональних антитіл. Діаметр мікрокапсул, розмір пор у них і їхня товщина можуть бути незалежно проконтрольовані в процесі виготовлення й оптимізовані для конкретного типу гібридом.

Таким чином, глибинне вирощування тваринних клітин можна реалізувати трьома варіантами:

1) моношар клітин статичний, а культуральне середовище рухливе;

2)середовище культивування статичне, а моношар клітин рухливий;

3) клітини (наприклад, на мікроносіях, у мікросферах) і середовище культивування рухливі.

Ці варіанти вирощування клітин слід брати до уваги за вибору або проектування відповідного обладнання.

Інші способи вирощування клітин. У наш час у дослідно-промислових умовах одержують інтерферон, вирощуючи лімфобласти людини у вигляді культур, коли певна частина клітинної суспензії заміщається свіжим середовищем, наприклад, иltrоsеr НY (Німеччина), а частина, що залишається, «старої» культури виконує роль інокулята. Інтерферони можливо отримувати в періодичній культурі, коли частину її відбирають через певні інтервали часу за безперервного підживлення свіжим поживним середовищем з постійною швидкістю його подачі. Тоді об'єм культури прогресивно зростає, так само як прогресивно знижуються швидкості її росту й розведення.

Як би довго не вдавалося підтримувати клітини в циклічних культурах із підживленням, в остаточному підсумку вони гинуть і весь цикл доводиться починати спочатку. Тривалий час можна вирощувати клітини ссавців у безперервних хемостатних культурах,коли вдається добиватися сталості концентрації субстрату, що лімітує, і щільності клітин. Теорія й практика безперервного культивування вперше сформульовані у 1950 р. Ж. Моно, і, незалежно від нього, А. Новиком і Л. Сцілардом, що запропонували термін «хемостат». У хемостатах швидкість подачі свіжого середовища й добору культури рівні (як і обсяг їх). Швидкість росту, розвитку й розмноження клітин контролюється швидкістю підведення компонента, що лімітує, а чисельність − його концентрацією. Як агент, що лімітує ріст, найчастіше використовують глюкозу, рідше − фосфат й інші речовини. За правильним підбором умов вирощування в хемостатах вдається на порядок збільшити вихід клітин порівняно з періодичним культивуванням. Причому, хемостатні культури відрізняються нагромадженням фізіологічно однотипних клітин.

Природно, що час, що витрачається на підготовку суміжних циклів і їхню реалізацію при періодичному культивуванні, є непродуктивним.

Дата добавления: 2017-02-01