Гібридизація тваринних клітин

Припущення про те, що соматичні клітини можуть зливатися одна з одною, було висловлено ще на початку XIX століття у зв'язку з відкриттям багатоядерних клітин (полікаріонів). В історичному аспекті викликає інтерес та обставина, що відкриття полікаріонів як би підтверджувало помилкове уявлення М. Шлейдена, який вважав, що нові клітини зароджуються у вигляді пухирців усередині цитоплазматичної мембрани батьківських клітин.

Гібриди соматичних клітин були відкриті лише у 60-х роках XXстоліття. У 1960 р. Панський зі співробітниками повідомили про виділення лінії гібридних клітин. Гібридні клітини були отримані шляхом змішування двох ліній, виділених раніше з однієї клітини мишачої саркоми. Вихідні лінії відрізнялися за кількістю й морфологією хромосом, а також за здатністю до утворення пухлини за введення їх мишам. Гібридні клітини містили число хромосом, відмінне від вихідних клітинних ліній, а також поверхневі антигени клітин обох батьківських ліній. Далі встановили, що клітинні гібриди можливо отримати, використовуючи клітини різних видів тварин. Агентом, що індукує злиття, виступав інактивований вірус HVJ, названий також вірусом Сендай. Із цього часу вірус Сендай став широко використовуватися в експериментах зі злиття клітин.

Зливатися можуть як клітини різного типу, що належать одному і тому ж виду (наприклад, мишачі фібробласти і мишачі лімфобласти), так і клітини тварин різних видів (наприклад, миша/людина, хом'як/курка, комар/людина). У першому разі батьківські клітини, що зливаються, розрізняються між собою за морфологічними, біохімічними, імунологічними або функціональ­ними властивостями, а продукти злиття є внутрішньовидовими гібридами. У другому разі створюються міжвидові гібриди, що відрізняються від початкових батьківських клітин, у першу чергу, генотипово. Багатоядерні клітини (полікаріони), що створилися внаслідок злиття клітин двох різних типів (А і В), можуть бути у трьох комбінаціях – АА, ВВ, АВ. Полікаріони, що містять ядра лише одного клітинного типу (АА і ВВ), називаються гомокаріонами; полікаріони, до складу яких входять ядра обох батьківських типів (АВ), належать до гетерокаріонів. Злиття у гетерокаріонах ядер після злиття клітин викликає створення клітинного гібриду − синкаріону (рис. 46).

За вивчення міжвидових гібридних клітин, здатних до проліферації, було зроблено два дуже важливих спостереження:

− у гібридах можуть виявитися обидва геноми;

− у довгоіснуючих міжвидових гібридах елімінуються хромосоми одного виду.

Злиття клітин не обов'язково повинно бути чимось стимульоване. Як іп vivo, так і іп vitro воно може проходити й без додавання спеціальних агентів. Незважаючи на те, що всі злиття такого роду можна вважати спонтанними, деякі з них постійно відбуваються в процесі онтогенезу, тобто, еволюційно запрограмовані. Дотепер нерозгаданою залишається одна із складних загадок біологи, яка полягає в тому, що мембрани, які є всередині клітини зливаються часто, тоді як мембрани, що розмежовують клітини, зливаються рідко.

Відбирають синкаріони, що створилися, за допомогою селективних середовищ. Для злиття використовують, як правило, клітини − ауксотрофи, тобто клітини, що позбавлені можливості синтезувати певну речовину, яка необхідна для їх росту. Але за наявністюцієї речовини у середовищі такі клітини можуть рости і розвиватися. У наведеномуприкладі клітина А є ауксотрофом заречовиною р, але при цьому здатна синтезувати речовину а, в той час як клітина В є ауксотрофом за речовиною а і при цьому синтезує речовину р. У разі, коли в середовищі відсутні речовини а і (і, гомокаріони А А і ВВ, так само як і клітини А і В, будуть гинути в зв'язку з відсутністю необхідних компонентів, а синкаріони АВ виживуть, оскільки кожна зі складових гібриду забезпечує іншу необхідними інгредієнтами.

Рис. 46. Схема злиття двох одноядерних клітин А і В, що належать тваринам двох різних видів

(за Рінгерцем Н. та Севіджом Р., 1979)

У той же час нормальні клітини в природних умовах украй рідко зливаються одна з іншою. Виняток становить процес запліднення. Крім того, як подібний рід, як виняток є і процес плазмогамії у вищихгрибів, коли одноядернігаплоїдні клітини зливаються, утворюючидвоядерні (дикаріони) організми. Такі клітини розмножуються мітотично, залишаючись двоядерними, і в результаті утворюють добре відомі плодові тіла.

У природних умовах злиття клітин відбувається й у ссавців. Наприклад, клітини можуть зливатися за формування м'язових трубочок. Ще в XIXстолітті було показано, що міофібрили поперечносмугастих м'язів утворюються в полікаріонах − великих подовжених багатоядерних клітинах. Полікаріони − продукт злиття одноядерних міобластів. Злиття пухлинних клітин − досить звичайне явище, при цьому пухлинні клітини іп vivo іноді зливаються й з нормальними. Експерименти спонтанного злиття клітин проводилися й іп vitro. За проведення подібних експериментів одержують так званих химерних або алофенних мишей −тварин, у тканинах яких містяться клітини різних генотипів.

Механізм злиття клітин. Для індукції злиття клітин використовуються речовини різної природи. Йони Са²⁺, поліетиленгликоль, лізолецитин, моноолеат гліцерину, вірус Сендай.

Лізолецитин − поверхнево-активна речовина ліпідної природи, продукт деградації лецитину шляхом обробки останнього фосфоліпазою А. Лізолецитин ушкоджує мембрани і токсичний для живих систем. Цитотоксичний ефект цієї речовини можна зменшити, знижуючи його концентрацію або додаючи під час обробки альбумін.

Моноолеат гліцерину також сполука ліпідної природи, але його пошкоджуюча дія менш виражена, а частота злиття клітин при застосуванні цієї речовини зростає в 4...7 разів порівняно зі спонтанним процесом. Інші аглютинуючі агенти, що здатні викликати злиття клітин, було досліджено спеціально. До них належать лектини рослин та антитіла.

Перевага вірусу Сендай як агента, що зливає, має здатність до злиття, в повній відсутності цитотоксичного ефекту. Вірус перед вживленням інактивують, опромінюючи ультрафіолетовою лампою протягом 5 хвилин, при цьому він втрачає здатність до розмноження, але зберігає можливість зливати клітини. Вірус Сендей має два недоліки:

− необхідно нарощувати. титрувати, концентрувати й інактивувати вірус;

− клітини рослин і грибів не мають рецепторів до цього вірусу, тому він не придатний для їх гібридизації.

Перший етап злиття − зближення мембран сусідніх клітин і встановлення між ними тісного контакту. Мембрани повинні бути наближені одна до одної на відстань у декілька ангстрем так, щоб між ними стали можливі взаємодії, подібні до гідрофобних зв'язків. Викликають подібне зближення агенти, що індукують аглютинацію клітин. Міксовіруси, наприклад, Сендай, поряд з іншими вірусами, які не обумовлюють злиття, насамперед викликають аглютинацію клітин, тобто досить тісне їх зближення, що необхідне для успішного наступного злиття.

Поліетиленгликоль також викликає агрегацію клітин, хоча механізм дії його невідомий. Можливо, завдяки тому, що у водяному розчині ПЕГ несе невеликий негативний заряд, молекули цього розміру досить великі, щоб між клітинами виникали електростатичні зв'язки. Підтвердженням цієї гіпотези є посилення аглютинації клітин, викликаної ПЕГ: двовалентні йони, очевидно, утворюють містки між ПЕГ і негативно зарядженими вуглеводами, що є на клітинній поверхні. Відповідно до іншої гіпотези, протопласти зливаються внаслідок дегідратації. Поглинання води індукує утворення пор на поверхні мембрани і відбувається перетікання внутрішньоклітинного матеріалу. Після злиття ділянки з порами певний час зберігаються. Існує два припущення, що пояснюють виникнення пор:

1. За високої концентрації ПЕГ (20...30%) уся вільна вода поглинається ним, викликаючи розриви в мембрані;

2. ПЕГ зменшує полярність води, що викликає перерозподіл полярних і гідрофобних компонентів мембрани, що стабілізують ліпідні шари.

3. З великим успіхом для цих цілей використовується ПЕГ з молекулярною вагою від 1500 до 7500.

Пектини й антитіла − дво- або полівалентні сполуки; їхня аглютинуюча функція пов'язана зі здатністю однієї молекули якоїсь із цих сполук взаємодіяти з рецепторами, що є на поверхні двох клітин, що й приводить до утворення зв'язку між клітинами. Достатня кількість таких молекулярних зв'язків може утримувати клітини разом, перешкоджаючи їхній розбіжності внаслідок броунівського руху або в через електростатичне відштовхування чи активну міграцію клітин.

На другому етапі гликопротеїди, що розташовані на поверхні, починають вивільнятися з ділянок мембрани, що лежать між віріонами, і притягуються до місць прикріплення вірусних часток. Вуглеводні компоненти − найменш вивчена частина клітинної поверхні. У мембранах вони бувають у вигляді нейтральних цукрів, а також ковалентно зв'язуються з ліпідами або білками. Саме в такому вигляді вони беруть активну участь у багатьох біологічних процесах. Установлено, що гликопротеїди обумовлюють антигенну специфічність клітин, несуть негативний заряд, характерний для клітин при фізіологічно нейтральних рН, беруть участь у розпізнаванні та адгезії клітин, визначають рецепторні ділянки для вірусів, бактерій, агентів, що здатні до аглютинації, приєднуються до процесу регуляції проникності мембран для йонів. Ці властивості й обумовлюють їх участь у злитті клітин.

Вуглеводи перешкоджають злиттю клітин, оскільки розподіляють ліпідні шари мембран, не даючи їм стикатися, тому що на поверхні нормальної клітини рецепторні ділянки розташовані рідко або поодинці. У результаті трансформації вірусом відбувається їхнє об'єднання в групи. Гликопротеїди мігрують у мембрані до місця адсорбції вірусу, залишаючи вільними сусідні ділянки, де й відбувається злиття клітин. У деяких випадках для видалення вуглеводних груп, що перешкоджають злиттю клітин, беруть участь лізосомні ферменти. При цьому відбувається з'єднання лізосом із плазматичною мембраною і локальне вивільнення глікозидаз. Така лізосомна активність може бути запрограмована (у гаметах, міобластах, макрофагах, тобто клітинах, що зливаються в природних умовах) або викликана експериментально за індукованого злиття клітин.

Третій етап − міцелізація ліпідів, що оголилися, двох протилежних мембран. Міцели − ліпідні краплі, де молекули ліпідів гідрофільними головками звернені до води, а гідрофобні «хвости» жирних кислот заховані усередину. Цей процес посилюється при високих значеннях рН і високої концентрації іонів кальцію. В обох клітинах починається ендоцитоз вірусних часток.

Четвертий етап − злиття мембран. Завдяки місткам, утвореним Са²⁺, розмір міцел зменшується. Під дією АТФ і Са²⁺ активізуються мікрофіламенти. Цитоплазматичний місток, що виник, стабілізується і розширюється завдяки функціонуванню мікрофіламентів. На останніх етапах злиття клітин важливу роль відіграє наявність АТФ. АТФ утворюється завдяки діяльності мітохондрій. Полікаріони, що створюються при злитті двох або трьох клітин, являють собою не безформні роздуті або дволопасні кулі цитоплазми, а приймають форму, характерну для однієї з батьківських клітин або проміжну між ними. Форму клітини обумовлюють мікротрубочки і мікрофіламенти. У процесі злиття клітин мікрофіламенти, які розташовані під цитоплазматичною мембраною, беруть безпосередню участь, тому що забезпечують об'єднання цитоплазм клітин, що злилися, і стабілізацію знову утвореної системи. Однак, формування цитоскелету − енергозалежний процес, що вимагає великої кількості АТФ. Можливо, цим обумовлена присутність мітохондрій у місцях злиття клітинних мембран.

Дата добавления: 2017-02-01