Моноклональні антитіла

Під впливом на організм тварини антигена, що містить значну кількість епітопів (антигенних детермінант, ділянок поверхні антигена, до яких створюються антитіла), клітини імунної системи продукують антитіла до кожного з них, завдяки наявності величезної кількості клонів лімфоцитів, що виробляють антитіла одного типу з вузькою специфічністю. Створюється суміш антитіл, тобто поліклональна сироватка. Спектр антитіл, що створюються, змінюється під час імунної відповіді, а також за використання різних тварин.

Багато дослідників намагалися найти способи отримання антитіл з вузькою специфічністю. У 1975 році Д. Келер і Ц. Мільштейн запропонували принципово новий метод створення гомогенних антитіл. Внаслідок соматичної гібридизації (злиття) мієломних клітин (пухлинних клітин лімфоцитарної системи) і В-лімфоцитів, які продукують антитіла після імунізації тварин відповідним антигеном, було отримано клони гібридних клітин − гібридоми, що синтезують моноклональні антитіла (моноАТ, або моноати).

Передумовою для виникнення методу отримання гібридів, що синтезують моноклональні антитіла, була розробка двох методичних підходів:

1) отримання мієлом, адаптація їх до умов культивування поза організмом

2)метод соматичної гібридизації клітин.

У мишей досить легко можна отримати мієломи. Ці пухлини єнащадками однієї клітини (тобто мають моноклональне походження). Пухлини індукують у тварин шляхом внутрішньочеревного введення мінеральних масел або інертного твердого пластика. Однак, необхідні мієломи вдалося отримати лише в двох лініях мишей. Виявилося також, що білки, що продукують мієломні клітини, володіють невідомою антигенною специфічністю і можуть здійснювати негативний вплив на синтез необхідних антитіл. Тому в наш час, як правило, використовують варіанти мієлом, що не здатні створювати власні імуноглобуліни, і вся гібридомна продуктивність спрямована на синтез величезної кількості моноклональних антитіл зі специфічністю, яка цікавить дослідників. Ще однією особливістю мієлом, що використовуються для гібридизації, є відсутність у них ферменту гіпоксантинфосфорибозилтрансферази, який бере участь у синтезі ДНК. Цей фермент забезпечує запасний шлях синтезу аденозинмонофосфату в тому випадку, коли звичайний ланцюг ферментативних реакцій заблокований (наприклад, за присутності інгибітора − аміноптерину). На поживному середовищі, яке містить гипоксантин, аміноптерин і тимидін (ГАТ-середовище) такі мієломні клітини розмножуватися не здатні. Тобто мієломні клітини є ауксотрофами − клітинами-мутантами, які позбавлені певної ділянки гена, що відповідає за синтез ферменту, необхідного для підтримки процесів життєдіяльності клітини у селективному середовищі. Партнером для злиття з мієломою є імунні лімфоїдні клітини селезінки або лімфовузлів, що самі по собі нежиттєздатні в культурі.

Другою передумовою методу створення гібридом є техніка гібридизації соматичних клітин. Злиття клітин лімфоцитів з мієломами може здійснюватися і спонтанно, однак вихід гібрида зростає в присутності 40...50% розчину поліетиленгліколю (ПЕГ) або в апараті для електрозлиття (рис. 47).

Гібридоми відбирають за властивістю розмножуватися на ГАТ-середовищі. Здатність мієломних клітин до швидкого розмноження відновлюється за рахунок додавання клітинам селезінки генів, що відповідають за синтез ДНК по запасному шляху. Селекція на ГАТ-середовищі дозволяє позбавитися мієломних клітин, які не злилися, або злилися одна з одною і відіграє важливу роль через дуже малий вихід процесу гібридизації (один гібрид на 500 тис. клітин селезінки).

Однак, не всі клітини, що ростуть на ГАТ-середовищі, є гібридомами − продуцентами специфічних антитіл. Тому важливим етапом отримання гібридом є відбір клітин, що стабільно синтезують антитіла до антигену. Засновано цей відбір на визначенні певних антитіл і здійснюється за допомогою імуноферментного аналізу.

Рис. 47. Схема отримання моноклопальних антитіл

Антитіла, що виявлені на цій стадії, не обов'язково є моноклональними. В осередку, де культивуються клітини, може бути виявлено дві і більше гібридом, кожна з яких синтезує власний тип антитіл. Тому наступним етапом після селекції є клонування гібридом, метою якого є розподілення клітин і нарощування окремих клонів з однієї клітини. Важливою особливістю клонування є те, що воно дозволяє не лише позбавитися від клітин, що втратили здатність синтезувати антитіла, а і відібрати клони необхідної специфічності із стабільними спадковими властивостями.

Гібридоми, які вирощують у судинах для культивування, синтезують 5... 10 мкг антитіл на 1 мл середовища. За використання спеціальних носіїв кількість антитіл можна збільшити до 100 мкг/мл.

Найважливішою властивістю гібридом, яку вони успадкували від мієломних клітин, є їх здатність створювати асцитні пухлини за введення мишам і синтезувати при цьому до 15 мг антитіл на 1 мл асцитної рідини.

Таким чином, процес отримання гібридом, що синтезують певні моноклональні антитіла, складається з таких етапів:

1. Імунізація мишей, що відбувається в три (якнайменше) етапи:

− внутрішньочеревне введення антигена з повним ад'ювантом Фрейнда (ад'юванти − це сполуки, які при введенні в організм викликають неспецифічне збільшення імунної відповіді і тим самим підвищують здатність організму реагувати на будь-який імуноген). Повний ад'ювант Фрейнда, що дуже широко використовується в наш час для імунізації, складається з суміші мінеральних масел, емульгатора і вбитих мікобактерій (за відсутності бактерій ад'ювант називається неповним);

− повторне введення антигена через 4...5 тижнів з неповним ад'ювантом Фрейнда;

− внутрішньочеревне і внутрішньовенне введення антигена за З...4 дні до злиття без ад'юванта.

2. Злиття клітин. Селезінку імунізованої миші подрібнюють у гомогенізаторі. У наступному клітини селезінки і мієломні клітини центрифугують і додають розчин ПЕГ, що полегшує процес злиття клітин. До суміші додають ГАТ-середовище і розносять по лунках. Через 7... 10 днів відбирають культуральну рідину з кожної лунки і тестують на наявність антитіл.

3. Тестування гібридом. Тестування проводять за допомогою методів імуноферментного аналізу (ІФА), при цьому одночасно визначають ферментативну активність антитіл, що створилися.

4.Клонування гібридом проводять або в напіврідкому агарі, або методом граничних розріджень. Вміст лунок, у яких отримали позитивний результат при тестуванні, оцінюють під мікроскопом для оцінки числа гібридом. У подальшому розріджують до концентрації З клітини/мл і розподіляють по лунках. Через 10 днів окремі клони зновтестують методом ІФА.

5. Нарощування гібридом. Клони, що виявилися позитивними, нарощують, доки вони не займуть 2/3 поверхні лунки 96-лункової плати. Потім їх переносять до лунки 24-лункової плати, а за декілька діб їх об'єднують і пересаджують у 50 мл флакони для культивування. За необхідності клітини можуть бути перенесені в судини для культивування об'ємом 250 мл і більше.

6. Нарощування гібридом у вигляді асцитної рідини. Мишам внутрішньочеревно вводять 10⁶.... 10⁷ клонованих гібридомних клітин у розчині для підтримки їх росту. На 14...21 добу відбирають 4... 5 мл асцитної рідини.

7. Заморожування гібридомних клітин. Заморожування необхідно здійснювати на всіх стадіях отримання гібридом. Швидкість зниження температури 1°С за 1 хв. Клітини вносять у спеціальні ампули, які розміщують у холодильнику (-70°С), а далі переносять у рідкий азот. Розморожують клітини швидко, поміщають ампули у водяну баню за температури 37°С. Розморожені клітини розріджують гібридомним середовищем, центрифугують і осад розміщують у лунках плат з розчином для росту клітин.

8. Зберігання моноклональних антитіл. Культуральна рідина з моноклональними антитілами добре зберігається протягом одного року за температури 4°С у присутності 0,1% азиду натрію. Вона може зберігатися невизначено довго за температури -70°С; при цьому необхідно запобігати повторного заморожування-відтаювання. Асцитна рідина повністю стабільна при зберіганні у стерильному стані за температури 4°С.

Лікарські речовини, що пов'язані з моноклональними антитілами. Часто ліки, які використовують при певних захворюваннях не виявляють необхідна ефективності, що може бути пов'язане з тим, що вони не доходять до органу чи клітини необхідної концентрації. Для полегшення доставки лікарської речовини до місця дії можна приєднувати її молекули до моноклональних антитіл специфічних по відношенню до певних ділянок поверхні визначених клітин, наприклад, пухлинних (рис. 48).

Для цього потрібно, щоб моноклональне антитіло було в необхідній кількості і достатньо очищене, зв'язувалося з високоспецифічним білком клітини-мішені і за необхідності мало здатність проникати в середину пухлини. У цьому разі доза лікарської речовини, що необхідна для лікування, значнозменшується порівняно з безпосереднім використанням.

Рис. 48. Схематичне зображення системицільової доставки лікарської речовиниз використанням моноклональних антитіл

Першою стадією за отримання гібридних моноклональних антитіл, які містять два різних центри для зв'язку з антигенами, один з яких спрямований до певного антигена, а іншій − до ферменту або лікарської речовини, є створення звичайної гібридоми, що синтезує моноклональні антитіла. Цю гібридому, яка відіграє роль мієломної клітини, зливають з лімфоцитами, отриманими при імунізації мишей іншим антигеном (ферментом або лікарською речовиною). Внаслідок злиття і відбору створюється вторинна гібридома, що здатна синтезувати антитіла подвійної специфічності.

У наш час головним чином отримують гібридоми, що синтезують моноклональні антитіла миші або пацюка. Однак, їх не завжди можна використовувати з медичною метою. Для отримання ізотипів гібридом людини було випробувано гібридизацію мієлом пацюка з лімфоцитами людини. Однак, практичного значення такі гібридоми не знайшли через генетичну нестабільність.

Ще один підхід полягає у введенні імунних клітин людини мутантним мишам, які практично позбавлені власної імунної системи. Після трансплантації імунних стовбурових клітин людини цим мишам, вони набувають клітини імунної системи людини і у відповідь на введення антигена можуть виробляти антитіла людини.

Також спробували ввести до зародка мишей гени імуноглобулінів людини з метою створення трансгенних мишей, які увідповідь на імунізацію певним антигеном будуть здатні виробляти імуноглобуліни людини. Для отримання від трансгенних тварин клітин, що синтезують специфічні моноклональні антитіла, можна використовувати стандартну гібридомну технологію, потім провести скринінг (тотальний відбір) позитивних клітинних ліній і визначити тих, що створюють антитіла та кодуються генами імуноглобулінів людини.

Однак, усі ці методи дуже складні і моноклональні тіла, що створюються незначною кількістю, дуже дорогі, що не дозволяє широко використовувати їх у лікуванні. Для вирішення цієї проблеми була спроба створити так звані біореактори на основі генетично модифікованих бактерій, рослин і тварин.

Методика отримання функціональних, антитіл за допомогою Е. coli така:

1. На підставі мРНК, що виділена з клітини В-лімфоциту миші або людини, синтезують кДНК. Необхідно враховувати, що молекула антитіла (імуноглобуліну) складається з двох легких (L) і двох важких (Н) білкових ланцюгів, які з'єднані водневими зв'язками. Кінцеві ділянки L- і Н-ланцюгів створюють антигензв'язуючий сайт. Окремі домени (частини) молекули антитіла виконують різні функції, що спрощує маніпуляції з генами антитіл.

2. Проводять окрему ампліфікацію (множення) кДНК, що кодує Н-іL-ланцюги.

3. Ампліфіковані кДНК обробляють специфічними рестриказами і вбудовують у вектор на основі бактеріофага . Оскільки кДНК Н- і L-ланцюгів містять різні сайти рестрикції, кожна нуклеотидна послідовність вбудовується у власний вектор. На цьому етапі також здійснюється клонування багатьох різних сегментів Н- і L-ланцюгів.

4. кДНК Н- і L-ланцюги об'єднують в одному комбінаторному векторі при цьому створюється широкий спектр генів різних антитіл (за рахунок комбінацій різних ділянок). Пул антитіл ссавців включає 10⁶...10⁸ різних антитіл. Бібліотека на основі комбінаторного вектора або комбінаторна бібліотека містить майже таку ж кількість клонів, тобто можна очікувати, що вона вироблятиме таку ж кількість різних антитіл.

6. Скринінг клітин для виявлення антигензв'язуючої активності антитілВектор, що містить кДНК Н- і L-ланцюгів уводять у клітину Е. соli.

7. Виділення моноклональних антитіл із клітин Е. соli. Застосування моноклональних антитіл. Найбільш широковикористовуються моноклональні антитіла в медичній діагностиці. Якщо до антитіл приєднати радіоактивні або магнітоактивні матеріали й ввести їх у живий організм, то можна виявити в ньому патологічні зони. Такі моноати приєднуються до уражених хворобою клітин організму, а відповідні індикаторні матеріали дозволяють з'ясувати їхнє місцезнаходження.

Моноати використовуються й у процесах очищення речовин. Сучасні технології засновані на приєднанні антитіл до твердої матриці носія. До них додають суміш молекул, що містить антиген, який шукають. Потім комплекси антиген-антитіло відмиваються від домішок, не пов'язаних з матрицею. Після руйнування ковалентних зв'язків антиген-антитіло в розчині залишаються вільні антигени.

Якщо отримати антитіла певного типу й імунізувати ними тварину, то утворюються анти-антитіла (анти-ідіотипні антитіла). Вони діють на імунну систему як псевдоантиген і тому можуть бути використані для її стимуляції. На цьому принципі засновано одержання вакцин нового типу. Набори моноатів можуть бути також призначені для боротьби з алергенами.

Моноклональні антитіла застосовуються у медичній терапії для знайдення «мішені». Припускається, що різні ракові захворювання обумовлені активацією ендогенних генів, які викликані хімічними агентами, внутрішніми хромосомними перебудовами. Ці гени кодують певні білки, і тому ракові клітини можуть містити унікальні білки на поверхні клітини. Можливо, саме ці білки беруть участь у супресії росту здорових клітин. Інактивуючи ці білки, можна гальмувати ріст ракових клітин.

Завдяки високій специфічності моноати широко використовуються як зонди для точного визначення природи молекул поверхні клітин і клітинних органел. З їхньою допомогою також можна проводити детекцію активності ферментів.

Метод молекулярної гібридизації (ММГ) − заснований на принципі взаємодії вірусних геномів з комплементарними до них ділянками ДНК, які помічені радіоізотопами або ферментами, чи фарбами. Для визначення структури вірусних геномів використовують моноати. Певне антитіло здатне зв'язуватися з певною антигенною детермінантою або певною речовиною, що синтезує вірус. Знаючи структуру антитіла можна з'ясувати структуру антигена і на підставі цього визначити ділянку гена, що відповідає за синтез антигена. Ділянку ДНК гена, що було визначено, можливо синтезувати або виділити з генома вірусу і використовувати для проведення досліджень.

Поряд з безсумнівними перевагами моноклональні антитіла мають і недоліки. Вони нестабільні за зберігання у висушеному вигляді, в той час як суміш звичайних (поліклональних) антитіл завжди містить групу антитіл стійких при обраних умовах. Моноклональні антитіла часто мають надто низьку спорідненість до антигена і надмірно вузьку специфічність, що не дозволяє їх використання проти мінливих антигенів, які характерні для інфекційних агентів і пухлинних клітин. Тому одним із завдань біотехнології є розробка методів, засобів, прийомів клітинної інженерії, що будуть сприяти створенню нових форм продуцентів або формуванню принципово нових способів їх культивування.

Дата добавления: 2017-02-01