Введення клітин у культуру

Для культивування поза організмом живі клітини можуть бути отримані декількома способами. Вони можуть бути виділені із крові, але до росту в культурі здатні лише лейкоцити. Моноядерні клітини можуть бути виділені з м'яких тканин за допомогою таких ферментів як колагеназа, трипсин, проназа, що руйнують позаклітинний матрикс. Крім того, у поживне середовище можна помістити шматочки тканин.

Відповідно до мети і завдань експериментальної роботи можна виділити два напрямки культивування клітин тварини:

− культури клітин;

− культури органів і тканин (органні культури).

Культури клітин позбавлені структурної організації, втрачають характерну гістіотипову архітектуру й пов'язані з нею біохімічні ознаки і, звичайно, не досягають зрівноваженого стану за відсутністю спеціальних умов. Клітини в культурах розмножуються, що забезпечує одержання великої маси клітин, потім їх ідентифікують (за фенотиповими ознаками, шляхом вирощування на селективному середовищі, генотиповими), розділяють на ідентичні паралелі і, якщо це необхідно, зберігають.

Список типів клітин, що вже введені в культуру, досить великий. Це елементи сполучної тканини людини (фібробласти), скелетні тканини (кістка й хрящі), скелетні, серцеві і гладенькі м'язи, епітеліальні тканини (печінка, легені, нирки й ін.), клітини нервової системи, ендокринні клітини (наднирники, гіпофіз, клітини острівців Лангерганса), меланоцити й різні пухлинні клітини.

Популяція клітин не завжди гомогенна й має фіксований фенотип. Деякі культури, наприклад, кератиноцити епідермісу, містять стовбурові клітини, клітини-попередники й кератинизовані лускаті клітини. У такій культурі відбувається постійне оновлення за рахунок стовбурних клітин, проліферація і дозрівання клітин-попередників, а також необоротна диференціація, що супроводжується «лущінням» лускатих клітин до культурального середовища.

Яку тканину краще брати для введення в культуру, дорослу або ембріональну, нормальну або пухлинну? Культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращою виживаністю й більш активним ростом порівняно з відповідними зрілими тканинами. Причиною цього є низький рівень спеціалізації й наявність клітин-попередників, що реплікуються, в ембріонах. Проліферативна (від лат. рrоlеs нащадки + fасеrе робити; розростання тканини шляхом новоутворення клітин) здатність дорослих тканин нижче, вони містять більше спеціалізованих клітин, що не подвоюються. Одержання первинних культур клітин дорослих тканин і їхнє розмноження є більш складним завданням, тривалість життя таких культур, як правило, невелика. Нормальні тканини дають початок культурам з обмеженим часом життя, в той час як культури, отримані з пухлин, здатні проліферувати необмежено довгий час. Диференціація нормальних клітин у культурі звичайно супроводжується повним припиненням проліферації клітин. У культурах пухлинних клітин можлива часткова диференціація за збереження здатності до проліферації.

Свіжоотримані культури називаються первинними культурами до початку пасирування або субкультивування. Пасирування (розділ) клітин − це відбір невеликої кількості клітин для вирощування в іншій лабораторній судині. Культуру клітин можна використовувати значно довше, якщо регулярно здійснювати відбір клітинного матеріалу, що дозволяє запобігти передчасному старінню культури внаслідок підвищення щільності заселення клітин. Суспендовані культури (окремі клітини, що розташовані в поживному середовищі) пасирувати простіше, тому що для цього досить лише відібрати необхідну кількість клітин, помістити їх в інші судини і додати свіже поживне середовище. Адгезивні ж клітини (від лат. adhaesio прилипання) перед цим варто розділити. Найчастіше для цієї мети використають суміш трипсину або інші ферментні суміші. Невелика кількість клітин, що розподілені, може бути використана для заселення нової культури.

Клітини первинної культури зазвичай гетерогенні й характеризуються низькою проліферацією. У них найбільш повно представлені типи клітин тієї тканини, звідки вони були отримані. Пасирування забезпечує можливість продовження існування культури, можливість клонування, дослідження йзбереження властивостей клітин. При цьому утворюються більш однорідні популяції, а також втрачаються спеціалізовані клітини. Після декількох пересівань лінія клітин або гине, або трансформується й стає постійною клітинною лінією. Властивістю «безсмертя» володіють, головним чином, клітини, отримані з пухлин. Поява постійної лінії клітин констатується за морфологічними змінами (зменшення розміру клітин, зниження їх адгезивності, округлення, збільшення ядерно/цитоплазматичного відношення), за збільшенням швидкості росту (час подвоєння клітин у культурі знижується з 36...48 до 12...36 годин), за зниженням залежності від сироватки, за збільшенням ефективності клонування, за зниженням залежності від субстрату, за збільшенням гетероплоїдності (хромосомні різниці між клітинами) і анеуплоїдності. Нормальні клітини можуть трансформуватися в постійну лінію, не стаючи при цьому злоякісними.

Дата добавления: 2017-02-01