Поживні середовища і умови культивування

Після витягнення клітин із тканини або організму й переміщення їх до культури, культуральне середовище повинно забезпечувати всі зовнішні умови, які клітини мали іп vivo. Це сприяє виживанню клітин, їхній проліферації й диференціації. Позаклітинне середовище повинно забезпечувати клітини поживними і гормональними факторами, тобто володіти всім необхідним для росту й виживання клітин.

Культури клітин тварин і людини висувають певні вимоги до рідкої (поживне середовище), газоподібної (концентрація газів) і твердої (поверхня субстрату) фази. Поживне середовище − це розчин певного складу, до якого додаються компоненти нез'ясованого біологічного походження (добавки плазми, сироватки крові, екстракти тканини й т.ін.). Основу поживних середовищ становлять сольові розчини. Мінеральні компоненти в цих розчинах підібрані так, що розчин виконує буферні функції, підтримуючи постійний кислотно-лужний баланс середовища в процесі культивування. Сталість рН середовища є одним з головних вимог умов культивування.

Для приготування поживних середовищ звичайно використовуються сольові розчини Ерла й Хенкса. Ці розчини, як і фосфатносольовий буфер Дульбекко й Фогта використовуються також для зрошення й промивання клітин за пасажирування культур, виділення клітинних ліній та інших маніпуляцій з культурами клітин. Важливою умовою культивування є також осмотичний тиск. Він визначається числом молів осмотично активних часток (йонів і нейонізованих молекул) розчинених речовин на 1 кг розчинника (осмоляльність) або на 1 літр розчину (осмолярність). У розведених водяних розчинах ці величини близькі.

Стандартні середовища для ведення культур тваринних клітин. Середовища Ігла МЕМ (тіпітаl еssепіtаl теdіит) і ВМЕ (bаsаl теdіит, Еаg1е). Частіше використовується МЕМ. Воно містить мінеральні речовини, амінокислоти (13 незамінних), 6 водорозчинних вітамінів, холін й інозит, що виконують роль вуглеводного субстрату. МЕМ використовується тільки із сироваткою, тому що в ньому відсутні біотин, вітамін В₁₂, йони заліза та мікроелементи. Основою є розчин Ерла.

Середовище ДульбеккоDМЕ або DМЕМ (подвійна модифікація середовища Ігла). Використовується за культивування клітин різних типів, у тому числі нетрансформованих клітин і гібридом. Є основою для безсироваткових середовищ. Містить подвійну концентрацію амінокислот, гліцин, серин, піруват, залізо. За використання цього середовища необхідний інкубатор з 10% концентрацією С0₂.

Середовище Іскова ІМDМ — модифікація середовища Дульбекко. До нього додано незамінні амінокислоти, біотин, вітамін В_!2, селеніт натрію. До середовища введено НЕРЕ5 і зменшено концентрацію NaC1 і NаНС0₃. Середовище без сироватки звичайно використовується для культивування лімфоцитів і кровотворних клітин.

Середовище МакКоя 5А і серія середовищ RРМІ. Середовище МакКоя 5А розроблено у 1958 році для підтримки клонального росту клітин карциносаркоми Уолкера 256 за наявності сироватки, та в наступному − інших первинних культур і різних клітинних ліній. Виробляється в модифікації Івката й Грейса (RРМІ) і призначене для культивування лейкоцитів за наявності сироватки, часто застосовується і для культивування гібридом. Концентрація СО₂ в атмосфері за культивування становить 5%.

Середовище 199 розроблено у 1950 році для культивування фрагментів серця з ембріона курчати. Для середовища характерний широкий спектр поживних речовин і невисока їхня концентрація.

Використовується без добавок для підтримки первинних клітин, а із сироваткою − як ростове середовище для клітин, що швидко розмножуються. Нормальні клітини, що зберігають специфічні функції, не розмножуються на стандартних середовищах. Для оптимального росту клітин звичайно додають 5...20% фетальної (ембріональної) сироватки.

Сироватка являє собою надзвичайно складну суміш дрібних і великих молекул, здатних як викликати, так і гальмувати ріст клітин. До головних функцій сироватки належать: забезпечення гормональними факторами, що стимулюють ріст клітин і їхні функції; забезпечення факторами прикріплення й розпластування клітин; забезпечення транспортними білками, що переносять гормони, мінеральні речовини, ліпіди й т.ін. Білки сироватки, що безпосередньо і специфічно беруть участь у стимуляції клітинного розподілу, називаються факторами росту.

Більшість ростових факторів присутні у сироватці вконцентрації декількох нанограмів на мілілітр і нижче. Деякі із цих факторів специфічні для клітин на певній стадії диференціації, дія інших не обмежена якимось одним типом клітин. Той самий типклітин може бути стимульований різними ростовими факторами. Наприклад, фібробласти розмножуються у відповідь на факториросту фібробластів, епідермісу, тромбоцитів й соматомедину. Всі ціречовини є мітогенами (стимулюють мітоз). Важливим факторомросту практично для всіх типів клітин є гормон інсулін. З іншихгормонівнайчастіше ззастосовуютьсяглюкокортикоїди

(гідрокортизон, дексаметазон), стероїди (естрадіол, тестостерон, прогестерон) і гормони щитовидної залози (трийодтиронин). Гормони стимулюють або пригнічують ріст залежно від типу клітин і їх щільності. Глюкокортикоїди, наприклад, впливають на проліферацію клітин, змінюючи їх чутливість до факторів росту.

Для перенесення низькомолекулярних факторів (вітамінів, амінокислот, ліпідів й інших) необхідні транспортні білки. В цій ролі виступає альбумін. Транспортування заліза забезпечує трансферин, а поверхня більшості клітин, що культивуються, містить рецептори для цього білка. До факторів прикріплення й розпластування клітин належать колаген і фібронектин.

Останніми роками розроблено середовища без сироватки для розмноження клітин. Найчастіше ці середовища вузькоспеціалізовані, тобто призначені для певного типу клітин. До базового середовищадодається інсулін, трансферин, гідрокортизон або його аналог дексаметазон і т.ін.

Безсироваткові середовища мають певні переваги:

− поліпшення відтворюваності результатів досліду внаслідок більшої стабільності складу середовища;

− зниження ризику зараження культури вірусами, грибами, мікоплазмою;

− полегшення очищення продуктів клітинного метаболізму; зниження впливу додаткових білків на результати біологічних досліджень;

− відсутність цитотоксичності сироватки.

Культивування клітин за наявності сироватки має і ряд недоліків:

− для більшості тканин сироватка не є фізіологічною рідиною, з якої вони контактували у вихідній тканині (наприклад, сироватка викликає ріст фібробластів, але гальмує ріст епідермальних кератиноцитів);

− сироватка може бути цитотоксичною;

− спостерігається значна варіабельність складу сироваток різних партій;

− сироватки можуть містити недостатню кількість специфічних ростових факторів, що викликає необхідність додаткового їх введення до культур клітин.

Багато клітин ссавців, перш ніж розпочати проліферацію і створити клітинний моношар, повинні прикріпитися до субстрату й розпластатися на ньому. У зв'язку із цим встає питання підбору певного матеріалу. В наш час як субстрат використовують кілька матеріалів.

Скло − найкраще пирекс (алюмоборосилікатне скло), тому що натрійсилікатне скло може збільшувати лужність середовища і його необхідно кип'ятити в слабкій кислоті перед застосуванням. З кожним використанням придатність такого скла зменшується.

Пластик − найчастіше використають полістирол, полікарбонат, полівінілхлорид, тефлон та інші.

Метали − придатною є як неіржавіюча сталь, так і титан, тому що ці речовини хімічно інертні й мають високий негативний поверхневий заряд. Клітини прикріплюються за рахунок електростатичних взаємодій, тому поверхня культуральних судин повинна змочуватися і бути негативно зарядженою. Цього можнадосягти хімічною обробкою агентами, що окислюють, або фізичними впливами (високовольтним розрядом, ультрафіолетовим світлом, бомбардуванням високоенергетичними електронами). Іноді поверхню судини покривають речовиною, що полегшує прикріплення клітин. Найчастіше для цього використають колаген і поліамінокислоти.

Дата добавления: 2017-02-01