Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

ВИБІР ТА ОТРИМАННЯ ФРАГМЕНТУ ДОНОРНОЇ ДНК




Читайте также:
  1. VІ. Вибір суб’єктів каналу – визначення типів і видів посередників.
  2. Автотипний синтез кольору – отримання відтінків кольору на відбитку шляхом поєднання растрових або штрихових зображень, задрукованих фарбами різних кольорів.
  3. Аудит дотримання умов збереження основних засобів
  4. Вибір закону регулювання регулятора
  5. Вибір засобів реалізації імітаційної моделі
  6. Вибір кольору тексту й фону для електронних виданнях
  7. Вибір оптимального режиму роботи і відпочинку
  8. Вибір складу
  9. Вибір структури й оцінка параметрів систем регулювання
  10. Вибір ступеня деталізації опису об'єкта моделювання
  11. Вибір цифрової фотокамери

ВСТУП

Клонування сегменту донорної ДНК

шляхом ампліфікації усередині бактеріальної клітини........................ 21

Виділення ампліфікованих рекомбінантних молекул ДНК...................23

 

Добір клонів рекомбінантних ДНК..........................................................23

Селекція генетично-модифікованих клітин............................................26

 

РОЗДІЛ 2. МЕТОДИЧНІ АСПЕКТИ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ОКРЕМИХ ГРУП ОРГАНІЗМІВ..............................................................29

 

Генетична інженерія бактерій..................................................................29

 

Генетична інженерія грибів............................................ ..........................36

 

Генетична інженерія рослин......................................................................38

 

Генетична інженерія тварин.......................................................................47

 

РОЗДІЛ 3. ДОСЯГНЕННЯ ТА ПЕРСПЕКТИВИ

ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ........................................................................53

 

Досягнення та перспективи генетичної інженерії мікроорганізмів

для промислового виробництва біотехнологічних продуктів................53

 

Досягнення та перспективи генетичної інженерії рослин......................70

 

Досягнення та перспективи генетичної інженерії тварин......................87

 

 

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ.................................................92

 

 

Сучасний період розвитку біотехнології, зокрема промислове виробництво цільових продуктів за допомогою клітин живих організмів, характеризується розробкою інтенсивних технологічних процесів на основі цілеспрямованих фундаментальних досліджень біології продуцентів антибіотиків, ферментів, амінокислот, вітамінів, фізіологічно активних речовин, розробки та втілення екологічно чистих, безвідходних технологій та економічно оптимальних виробничих процесів. Виконання цих завдань повинно ґрунтуватися на використанні суперпродуцентів, створенні організмів, що несуть у собі нову генетичну інформацію. Розділбіотехнології, пов’язаний з цілеспрямованим конструюванням in vitro нових комбінацій генетичного матеріалу, здатного розмножуватися у клітині і змінювати її спадкові якості, називається генетична інженерія. Генетична інженерія складається з двох розділів – генної інженерії та геномної інженерії.

Генна інженерія вирішує завдання конструювання організмів з якостями і ознаками, які не властиві особинам даного виду. Термін “генна інженерія” був введений Е.Тейтумом в 1963 році. В результаті генно-інженерних маніпуляцій видова приналежність реципієнтних організмів не змінюється, але вони набувають нових якостей і ознак. Основними видами генно-інженерних маніпуляцій є синтез та виділення генів, модифікація генів, заміна промоторів та термінаторів, приєднання генів до векторних молекул, введення генів у реципієнтні клітини, їх клонування та експресія, локалізований мутагенез, вибіркова активація гена, “адресне” руйнування гена, «антисенсове» блокування гена або РНК, що він продукує. До “інструментів”, які використовуються у генно-інженерних дослідженнях, відносяться ферменти (рестриктази та інші нуклеази, ДНК – лігази, зворотні транскриптази та інші ДНК- та РНК-полімерази), а також вектори, адаптери, полілінкери, зонди, віруси, плазміди, транспозони тощо. Для перенесення генів від одного організму до іншого в залежності від об’єктів використовуються такі методи як трансдукція, кон’югація, транспозиція, злиття протопластів, трансформація, мікроін’єкції, мікробомбардування та ін.



Геномна інженерія– це конструювання нових організмів за рахунок поєднання геномів різних видів. Методи, що використовуються в геномній інженерії, також залежать від об’єктів досліджень. Так, для вірусів використовується рекомбінація in vivo та in vitro, для прокаріотичних клітин – міжвидова кон’югація та злиття протопластів, для еукаріотів – злиття рослинних протопластів, тваринних клітин, введення в клітини ізольованих метафазних хромосом, мікроін’єкції хромосом у ядра, перенесення ізольованих мітохондрій і хлоропластів та інші. Геномна інженерія – специфічний розділ генетичної інженерії, який розглядається в розділі дисципліни “Генетика” “Генетика прокаріотів”, “Мутаційна мінливість” та біотехнологічних дисциплінах.

Генетична інженерія на сьогоднішній день має добре розвинений “інструментарій”, розроблену методичну базу та сформовані напрями досліджень, результати яких застосовуються як для вирішення фундаментальних, так і прикладних завдань. Так, методи генетичної інженерії мають вирішальне значення при вивченні молекулярної структури геномів і генів та механізмів регуляції їх експресії. Молекулярна біологія, молекулярна генетика та генетична інженерія тісно переплітаються при вирішенні прикладних завдань у промисловому виробництві цільових біотехнологічних продуктів, створенні нових високопродуктивних штамів мікроорганізмів, сортів рослин та порід тварин, розробці нових методів лікування та синтезу перспективних фармацевтичних продуктів, екологічній біотехнології та інших галузях.

 

 

РОЗДІЛ 1. ТЕХНІКА ОТРИМАННЯ

ТА КЛОНУВАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

 

 

Основними етапами генно-інженерних маніпуляцій для отримання трансгенних організмів є одержання генів шляхом їх синтезу або виділення з клітин, конструювання рекомбінантних молекул ДНК, клонування генів або генетичних структур, введення у реціпієнтні клітини чужорідних генів або генетичних структур та синтез стороннього білка.

Рекомбінантною ДНК називається генетична конструкція із ДНК одного виду з вбудованими в неї елементами ДНК іншого виду або штучного гена. Тобто, рекомбінантними ДНК є штучно сконструйовані молекули ДНК, отримані в результаті поєднання in vitro чужорідних фрагментів ДНК з використанням методів генної інженерії.

Зазвичай, рекомбінантна ДНК вміщує такі основні компоненти як донорну ДНК та векторну ДНК. Донорна ДНК – це ділянка молекули ДНК організму-донора, в якій розміщується ген, що нас цікавить. Векторна ДНК – це автономна молекула ДНК, яка використовується в генній інженерії для перенесення генів від організму-донора в організм-реціпієнт, а також для клонування нуклеотидних послідовностей. Поєднання донорної та векторної ДНК призводить до отримання рекомбінантної ДНК.

Отримання рекомбінантних ДНК та їх клонування (розмноження) складається з наступних етапів:

1) вибір та отримання фрагменту донорної ДНК;

2) вибір та підготовка векторної ДНК;

3) поєднання донорної та векторної ДНК з утворенням рекомбінантної ДНК;

4) клонування сегмента донорної ДНК у складі рекомбінантної ДНК шляхом ампліфікації у середині бактеріальної клітини.

Одержання рекомбінантних ДНК проводиться в лабораторних умовах для подальшого використання їх у генетичній інженерії для створення трансгенних організмів. Оскільки донорна ДНК забезпечує привнесення принципово нового гена до реципієнтних клітин, а векторна ДНК забезпечує перенесення донорної ДНК від донора до хазяїна, їх вибір є відповідальним етапом техніки отримання рекомбінантних ДНК.

 

 

Як донорну при одержанні рекомбінантних ДНК використовують такі її типи як геномна ДНК, комплементарна ДНК та хімічно-синтезована ДНК.

Геномна ДНК – це ДНК, яку одержують з хромосом організму-донора. Оскільки геномна ДНК має великі розміри, перед подальшим використанням вона має бути розрізана на фрагменти, серед яких необхідно ідентифікувати потрібний ген. Розрізання геномної ДНК проводять за допомогою бактеріальних ферментів рестрикції (рестриктаз), які розщеплюють зв’язки між нуклеотидами ДНК у специфічних місцях – сайтах рестрикції. Рестриктаза розрізає ДНК на набір фрагментів рестрикції (рестриктів), які визначаються розташуванням сайтів рестрикції. В генетичній інженерії найчастіше використовують рестриктази, які утворюють на ДНК-фрагментах так звані “липкі кінці”, тобто кінцеві ділянки ДНК, складені тільки з одного ланцюга. Вони несуть неспарені нуклеотиди і можуть утворювати пари з комплементарною послідовністю нуклеотидів, “злипатися”. Прикладом рестриктази, яка утворює “липкі кінці”, може служити рестриктаза EcoRI, яка пізнає на ДНК будь-якого організму паліндромну послідовність:

5′-NNNGAATTCNNN-3′

3′-NNNCTTAAGNNN-5′, де N – нуклеотид,

і розрізає її тільки у специфічних для цієї рестриктази і цієї послідовності сайтах рестрикції – між нуклеотидами G і A кожної нитки паліндрому, тобто у місцях, які зображені стрілками:

5′-NNNGAATTCNNN-3′

3′-NNNCTTAAGNNN-5′.

Таким чином, після дії цієї рестриктази утворюються фрагменти з липкими кінцями (виділені жирним шрифтом):

5′-NNNG-3′ 5′-AATTCNNN-3′

3′-NNNCTTAA-5′3′-GNNN-5′.

Такі фрагменти можуть бути гібридизовані з іншими фрагментами, які мають такі ж липкі кінці. Одноланцюгове спарювання такого типу інколи називають гібридизацією. В результаті такої гібридизації між донорною та векторною (або між будь-якими іншими фрагментами ДНК) утворюється рекомбінантна ДНК.

Навіть, якщо ДНК була оброблена рестриктазою, яка утворює фрагменти не з липкими, а із “сліпими кінцями”, тобто без неспарених нуклеотидів, такі фрагменти можуть бути включені у процес гібридизації за участю ферментів, що здатні з’єднувати сліпі кінці, або ферментів, що здатні перетворити сліпі кінці на короткі липкі.

Взагалі, рестриктази відносяться до групи специфічних ендонуклеаз, які впізнають на двоспіральній ДНК певні, немодифіковані метильними групами нуклеотидні послідовності (сайти впізнавання) і розщеплюють зв’язки між певними послідовностями нуклеотидів (у сайтах розщеплення). Перша рестриктаза була виділена в 1968 році Мезельсоном і Юанем. На сьогоднішній день описано близько 2500 рестриктаз, виділених з різних мікроорганізмів. Рестриктази разом з ферментами метилазами у бактерій забезпечують функціонування системи рестрикції-модифікації. Метилазисайт-специфічно метилюють власні ДНК клітин під час їх реплікації, захищаючи від пошкодження власними рестриктазами. Рестриктази не пошкоджують власні, захищені метильними групами ДНК, але розрізають чужорідні ДНК, неметильовані у відповідних сайтах. Молекулярний механізм дії метилаз системи рестрикції-модифікації полягає у перенесенні метильних груп з S-аденозил-L-метіоніну на певні залишки цитозину (з утворенням 5-метилцитозину) або аденіну (з утворенням N6-метиладеніну), розташовані симетрично на кожному ланцюгу сайту впізнавання, якщо сайти представлені паліндромами. В результаті однойменні рестриктази перестають зв’язуватися з модифікованими сайтами та розщеплювати їх. Таким чином, біологічне значення рестриктазно-метилазних систем полягає у тому, що вони обмежують горизонтальне перенесення ДНК між видами і у такий спосіб підвищують стабільність геномів у мікроорганізмів.

У 1973 році американські дослідники X. Сміт і Д. Натанс запропонували номенклатуру для позначення ферментів системи рестрикції-модифікації, яка сьогодні є загальноприйнятою. У відповідності до цієї номенклатури, перша буква роду і дві перші букви виду бактерій, з яких виділили фермент, утворюють скорочену назву ферменту. Ендонуклеази позначають символом R, метилази – М. Якщо з клітин одного виду мікроорганізмів виділено два чи більше ферментів рестрикції, то їх нумерують відповідно римськими цифрами. Виходячи з цієї номенклатури рестриктази Е. соli позначають EcoRІ, EcoRII і т. д. Три різні рестриктази Haemophilus aegyptius позначаються HaeI, HaeII і HaeIII. Білки системи рестрикції-модифікації можуть кодуватися плазмідами і фагами, и тоді до назви ферменту додається назва позахромосомного елемента. Наприклад, назва EcoP1 відноситься до ферменту, який кодується фагом P1.

Як і всі ДНКази, рестриктази активні тільки в присутності іонів магнію. Для дії кожної з них в експериментальних дослідженнях підібрані оптимальні умови, головні з яких температура та склад буфера. Однак, задля зручності у роботі (але за рахунок падіння активності ферментів у 2-3 рази) склад буфера для більшості рестриктаз вдалося уніфікувати (10мМ Tris-HCl pH 7.5, 10 мM MgCl2 та 1 мМ дитіотрейтол), залишивши варіюючою величиною тільки іонну силу (концентрацію іонів натрію) реакційної суміші. За цим параметром ферменти розділені на чотири групи: активні при низькій (0 мМ NaCl), середній (50 мМ NaCl) і високій (100 або 150 мМ NaCl) іонній силі. Багато рестриктаз здатні працювати в середовищах з різною іонною силою. Ці властивості ферментів враховуються при плануванні експериментів з розщеплення ДНК одночасно або послідовно декількома рестриктазами. Оптимальна температура дії для більшості рестриктаз – 370С. Але, наприклад, SmaI активна при 250С, а рестриктази, виділені з термофільних бактерій (BstBI, TaqI та ін.), ефективні при 650С. Останні при 370С зберігають лише 10% своєї активності.

Типовий ферментативний гідроліз ДНК проводиться в об’ємі 20 мкл з використанням 0,1-1 мкг ДНК і 1 од. ферменту (кількість рестриктази, необхідна для повного розщеплення 1 мкг ДНК фага λ за 1 годину за рекомендованих умов). Коли розщеплення ДНК ведуть двома або більшою кількістю рестриктаз, то їх додають одночасно за умови, що вони працюють в однакових буферах. В протилежному випадку першим використовують фермент, який потребує меншої іонної сили. Після закінчення заданого терміну його дії іонну силу середовища підвищують і додають другий фермент. За необхідності реакцію зупиняють додаванням 0,5 М EDTA (pH 7.5) до кінцевої концентрації 10 мМ.

За основними властивостями, до яких входять кількість субодиниць, потреба у кофакторах, специфічність сайтів розщеплення та їх положення відносно сайтів впізнавання, рестриктази поділяють на чотири класи. Для роботи всіх рестриктаз характерною є потреба в іонах Mg2+, а для роботи ферментів класів I, II i III, окрім того, обов’язковою є присутність у середовищі АТФ та S-аденозилметіоніну.

Рестриктази класу I мають складну субодиничну структуру та володіють двома типами активностей – модифікуючою (метилюючою) та АТФ-залежною ендонуклеазною. Ферменти цього класу розщеплюють ДНК у довільних місцях на відстані від декількох сотень до декількох тисяч пар нуклеотидів від сайтів впізнавання і утворюють при цьому суцільний спектр фрагментів рестрикції. Оскільки за допомогою цього класу рестриктаз неможливо отримати фрагменти ДНК, строго детерміновані за розміром та вмістом інформації, рестриктази класу I практично не використовуються у генетичній інженерії для отримання рекомбінантних ДНК. Для біотехнології важливе значення мають рестриктазно-метилазні системи класу I E.coli, оскільки клітини цього виду (зокрема штаму К-12) використовуються для тестування чужорідної ДНК. Рестриктази і метилази E.coli класу I поєднані в один комплекс з білком S, який забезпечує зв’язок всього комплексу (К) з сайтом впізнавання, якщо сайт неметильований. Як і всі сайти впізнавання ферментів цього класу, EcоK-сайт несиметричний:

5′-AACNNNNNNGTGC-3′

3′-TTGNNNNNNCACG-5′ .

В процесі гідролізу ферментний комплекс R2M2S залишається зв’язаним із сайтом впізнавання. Субодиниці комплексу кодуються генами hsdR, hsdM та hsdS. Для запобігання деградації чужорідної ДНК її вводять, як правило, тільки у клітини, мутантні за геном hsdR.

Рестриктази класу IIскладаються з двох окремих білків: рестриктуючої ендонуклеази та модифікуючої метилази. Вони діють незалежно, що дуже зручно при експериментальних дослідженнях. У рестриктаз класу ІІ сайти розщеплення співпадають з сайтами пізнавання або знаходяться поряд з ними на строго визначеній відстані, що дозволяє отримувати фрагменти рестрикції визначеної довжини. З цієї причини рестриктази класу ІІ на відміну від рестриктаз інших класів широко використовуються у генетичній інженерії. Найбільш важливі характеристики цих рестриктаз – структура їхніх сайтів впізнавання та спосіб розщеплення ДНК. Вже відомо більше 500 рестриктаз типу II. За структурою сайтів впізнавання рестриктази класу ІІ поділяють на наступні підкласи.

Підклас ІІP представлений ферментами, які впізнають тетра-, гекса- та октануклеотидні послідовності з обертальної симетрією другого порядку (паліндроми). Рестриктази цього підкласу діють або на певні сайти, наприклад, TaqI-сайт

5′-TCGA-3′

3′-AGCT-5′,

або на сайти, в яких присутні альтернативні основи, що займають симетричні позиції. Наприклад, по чотири сайти впізнавання мають рестриктази HaeI і HaeII:

5′-(A/T)GGCC(A/T)-3′

3′-(T/A)CCGG(T/A)-5′

та

5′-PuGCGCPy-3′

3′-PyCGCGPu-5′,

відповідно, де Pu – пурин, Py – піримідин.

Підклас ІІW пізнають пента- та гептануклеотидні паліндроми, в центрі яких знаходиться один з двох альтернативних нуклеотидів або будь-який нуклеотид (N). Фланкуючі нуклеотиди у симетричних положеннях також можуть бути альтернативними. Наприклад, HinfI-сайт:

5′-GANTC-3′

3′-CTNAG-5′,

або DraI-сайт:

5′-PuGGNCCPy-3′

3′-PyCCNGGPu-5′.

Підклас ІІN представлений рестриктазами, які впізнають паліндроми, що перериваються декількома довільними нуклеотидами, наприклад SfiI-сайт:

5′-GGCCN5GGCC-3′

3′-CCGGN5CCGG-5′ .

Рестриктази підкласів ІІS та ІІT впізнають непаліндромні послідовності з 4-6 і більше пар нуклеотидів. Ці підкласи відрізняються тим, що у першому випадку рестриктази розщеплюють ДНК на визначеній відстані від сайта впізнавання (1-20 п.н.), а у другому – у самому сайті. Прикладом такої послідовності для підкласу ІІS може слугувати MnlI-сайт:

5′-CCTCN7-3′,

а для підкласу ІІT – SgrAI-сайт:

5′-CAGCCGGTCG-3′.

За способом розщеплення ДНК рестриктази класу ІІ розділяються на два типи. Рестриктази першого типу здійснюють ступінчасте розрізання ниток ДНК, коли положення зв’язків, що гідролізуються на різних нитках, не співпадають. В результаті у фрагментів ДНК утворюються одноланцюгові “липкі” кінці. Всі рестриктази підкласу ІІP утворюють фрагменти рестрикції з липкими кінцями. Прикладом цього типу рестриктаз є згадана вище ендонуклеаза EcоRI, яка формує 5′-одноланцюгові кінці. Виступати можуть і 3′-кінці як, наприклад, при дії рестриктази PstI:

5′-NNNCTGCAGNNN-3′

3′-NNNGACGTCNNN-5′.

PstI:

5′-NNNCTGCA-3′ 5′-GNNN-3′

3′-NNNG-5′ 3′-ACGTCNNN-5′.

Рестриктази другого типу виконують розрізи в співпадаючих зв’язках і утворюють тупі кінці.

Приклад дії рестриктаз другого типу:

5′-NNNCССGGGNNN-3′

3′-NNNGGGCCCNNN-5′

SmaI:

5′-NNNCСС-3′ 5′-GGGNNN-3′

3′-NNNGGG-5′ 3′- CCCNNN-5′.

У двох останніх прикладах сайти розщеплення співпадають із сайтами впізнавання. Саме такі сайти і дістали назву сайтів рестрикції. Коли вони представлені паліндромами, то на різних ланцюгах ДНК гідролізуються зв’язки, розташовані або симетрично відносно центру паліндрому, або в самому центрі. Це дозволяє попередні приклади записати у короткій формі: 5′-CTGCAG-3′ та 5′-CCCGGG-3′, причому знаки 5′ і 3′ можуть опускатися. Знак вказує на розташування зв’язків, які гідролізуються, що визначає кількість нуклеотидних ланок на кінцях, що виступають.

Для рестриктаз, які впізнають непаліндромні послідовності нуклеотидів і розщеплюють ДНК в стороні від сайтів впізнавання, в коротких записах вказують у скобках для кожного ланцюга відстані від них до зв’язків, що гідролізуються. Наприклад, рестриктазу HgaI характеризує запис GACGC(5/10). Він розшифровується наступним чином:

5′-NNGACGCNNNNNNNNNNNN-3′

3′-NNCTGCGNNNNNNNNNNNN-5′

HgaI:

5′-NNGACGCNNNNN-3′

3′-NNCTGCGNNNNNNNNNN-5′.

Багато рестриктаз, навіть виділених з бактерій різних родин, впізнають на ДНК однакові сайти. Такі рестриктази називають ізомерами. Вони розділяються на ізошизомери та гетерошизомери. Перші не тільки впізнають однакові сайти, але і однаково їх розщеплюють. Прикладом ізошизомерів є рестриктази BspRI, BsuRI, CltI, FnuDI, які мають єдиний сайт впізнавання GGCC. Гетерошизомерами є, наприклад, рестриктази Asp718I (5′-GGTACC-3′) та KpnI (5′-GGTACC-3′). Деякі рестриктази характеризуються великою кількістю ізомерів. Так, для BamHI знайдено 20 ізомерів, з них 4 ізошизомери.

Рестрикти, які мають однакові липкі кінці за рахунок дії однієї і тієї ж рестриктази або її ізошизомерів, здатні поєднуватися один з одним з відновленням сайту рестрикції між ними. Але однакові липкі кінці можуть утворитися і при дії на ДНК рестриктаз, які впізнають різні сайти. До таких ферментів відносяться, наприклад, рестриктази BamHI (5′-GGATCC-3′), BglII (5′-AGATCT-3′), BclI (5′-TGATCA-3′), XhoII (5′-PuGATCPy-3′) і MboI (5′-GATC-3′). Нуклеотидні залишки, які формують липкі кінці, тут підкреслені. Об’єднуватися у даному випадку будуть будь-які рестрикти, але відновлені між ними сайти будуть впізнаватися тільки рестриктазою MboI.

Рестриктази класу III,які рестриктази класу І, діють в одному комплексі з метилазами і впізнають несиметричні послідовності нуклеотидів. Комплекс складається з двох субодиниць. Здатність до специфічного зв’язування з ДНК притаманна тільки метилазі, тому її називають MS-субодиницею. Розщеплення ДНК R-субодиницями відбувається на визначеній відстані від сайтів впізнавання. Наприклад, рестриктаза EcoP1 характеризується сайтом AGACC (27/25). Рестриктази цього класу ще називають “лінивими”, оскільки вони забезпечують гідроліз у всіх сайтах.

Рестриктази класу IV представлені поки що унікальним ферментом Eco571, в одному поліпептичному ланцюгу якого присутні обидва типи активності – ендонуклеазна та метилазна. Фермент характеризується сайтом CTGAAG (16/14).

Всі рестриктази також поділяють на дрібноріжучі (впізнають сайти з чотирьох нуклеотидів) та крупноріжучі ( впізнають сайти з шести нуклеотидів). При випадковому розподіленні нуклеотидів в ДНК та однаковій зустрічаємості AT- та GC-пар ділянки, що складаються з чотирьох певних нуклеотидів, зустрічаються у середньому через 44=256 нуклеотидних залишків, ділянки з шести нуклеотидів – через 46=4096 нуклеотидних залишків, ділянки з n-нуклеотидів – через 4n нуклеотидні залишки. Виходячи з цього, кількість сайтів впізнавання на один геном або ген відомої довжини до деякої міри можна прогнозувати. Більш точний прогноз можливо зробити, оцінивши у сайті впізнавання і в піддослідній ДНК вміст AT- та GC-пар. Якщо сайт рестрикції виявиться у середині гена, то обробка рестриктазою приведе до його інактивації. Вірогідність цієї події дуже велика при використанні дрібноріжучих рестриктаз і значно менша при використанні крупноріжучих рестриктаз. З метою отримання неушкодженого гена розщеплення ДНК здійснюють, обробляючи її послідовно декількома крупноріжучими рестриктазами або ж використовують прийом “недорестрикції”, тобто рестрикцію здійснюють в таких умовах, за яких розщеплення відбувається лише в одному сайті з декількох можливих.

В генетичній інженерії використовуються виключно рестриктази класу II. Найбільш цінними є рестриктази, які утворюють липкі кінці. Деякі з них представлені в таблиці 1.

 

Таблиця 1

Деякі рестриктази, які використовуються у генетичній інженерії

Рестриктаза Послідовність ДНК, що впізнається рестриктазою Рестриктаза Послідовність ДНК, що впізнається рестриктазою
EcoRI G↓AATTC CTTAA↑G XhoI C↓TCGAG GAGCT↑C
HindIII A↓AGCTT TTCGA↑A HindII GPyC↓GPuC CPuG↑CPyG
BglII A↓GATCT TCTAG↑A Sau3A ↓GATC CTAG↑
BalI TGG↓CCA ACC↑GGT PvuII CAG↓CTG GTC↑GAC
PstI CTCGA↓G G↑AGCTC KpnI GGTAC↓C C↑GATGG
SalI G↓TCGAC CAGCT↑G XbaI T↓CTAGA AGATC↑T
EcoRII ↓CCAGG GGTCC↑ SacI GAGCT↓C C↑TCGAG
EcoRV GAT↓ATC CTA↑TAG Cfr61 CAG↓CTG GTC↑GAC
BsuRI GG↓CC CC↑GG DpnI GA↓TC CT↑AG

 





Дата добавления: 2014-01-05; Просмотров: 636; Нарушение авторских прав?;


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



ПОИСК ПО САЙТУ:


Рекомендуемые страницы:

Читайте также:



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2018) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление ip: 54.161.71.188
Генерация страницы за: 0.011 сек.