Клонування сегменту донорної ДНК шляхом ампліфікації усередині бактеріальної клітини

Клонування фрагмента донорної ДНК відбувається шляхом ампліфікації (множення фрагменту ДНК). Ампліфікацію ведуть усередині бактеріальної клітини із використанням прокаріотичних генетичних процесів, таких як бактеріальна трансформація, реплікація плазмід, ріст бактеріофагів. В процесі клонування рекомбінтна молекула ДНК входить у бактеріальну клітину і ампліфікується. Увійти до бактеріальної клітини молекули чужорідної ДНК можуть двома способами: способом трансформації і способом трансдукції.

При трансформації бактерії занурюють у розчин, що містить рекомбінантні молекули ДНК, які і потрапляють у бактеріальні клітини. При трансдукції рекомбінантна ДНК упаковується у білкову оболонку фага. Потім такі сконструйовані фаги змішують з бактеріями, у яких буде проводитися клонування, і фаги вводять рекомбінантну ДНК у бактеріальні клітини. У залежності від типу векторної системи при ін’єкції фагом відбувається або інтродукція рекомбінантної плазміди у цитоплазму бактеріальної клітини, або виробництво бактеріальною клітиною нового покоління фагів, що несуть рекомбінантну молекулу ДНК. Якщо події розгортаються за останнім сценарієм, вільні фагові частинки, які утворилися у бактеріальній клітині, виходять назовні і інфікують поряд розташовані бактерії.

Реплікація рекомбінантної плазміди у бактеріальній клітині відбувається автономно і необов’язково синхронно з поділом клітини. З цієї причини у клітині можуть бути присутні 2-4 і більше рекомбінантні плазміди. Після ампліфікації колонія бактерій буде вміщувати мільйони копій фрагмента донорної ДНК, поєднаної з ДНК вектора. Цей набір ампліфікованих копій вихідного фрагмента донорної ДНК усередині вектора для клонування називається клоном рекомбінантної ДНК. При реплікації рекомбінантних ДНК експлуатується звичайним механізм, який бактеріальна клітина використовує для реплікації, обов’язковою вимогою якого є наявність оріджину реплікації.

Клітини бактерії-хазяїна повинні забезпечувати всі умови для реплікації векторної ДНК і не містити елементів, що пригнічують реплікацію вектора чи перешкоджають добору. Зокрема, не можна використовувати клітини з активною системою рестрикції, оскільки це загрожує цілісності рекомбінантної ДНК. Вибір хазяїна залежить також від того, який вектор використовується для створення рекомінантної ДНК, плазмідний чи фаговий.

Найчастіше для молекулярного клонування рекомбінантної ДНК в якості хазяїна використовується штам Е. coli K12. Генетичні і фізіологічні властивості цього штаму добре вивчені, оскільки ще задовго до розвитку технології рекомбінантних ДНК він активно використовувався для вивчення генетики бактерій. Крім того, в клітинах штаму Е.соlі К12 можуть реплікуватися різні бактеріофаги і плазміди – потенційно корисні векторні ДНК. Це й обумовило його переважне використання в експериментах з рекомбінантними ДНК.

Дата добавления: 2014-01-05