Генетична інженерія грибів

Трансген може бути введений в еукаріотичну клітину різними методами, включаючи трансформацію, ін’єкцію, бактеріальну та вірусну інфекцію, бомбардування золотими або вольфрамовими частинками, вкритими ДНК. Коли трансген попадає в клітину, він здатний пройти до ядра і стати стабільною частиною геному після вбудовування в хромосому або реплікуватися як частина плазміди. Якщо відбувається вбудовування, то трансген або заміщує резидентний (постійний) ген або вставляється ектопічно, тобто не замість гена реципієнта, а в інші місця геному. Сторонні гени частіше за все вставляються ектопічно.

Більшість методик генетичної інженерії еукаріотів була розроблена на дріжджах. Зручними об’єктами для генетичної інженерії є пекарські дріжджі Saсcharomyces cerevisiae. В суспензії дріжджі ростуть у вигляді окремих клітин, а на твердому субстраті утворюють колонії подібно Е.соlі. Подвоєння клітин на звичайному поживному середовищі здійснюється за 1,5-2 години. А тому відносно швидко і без особливих витрат можна отримати велику кількість цих непатогенних організмів. Гаплоїдний геном Saсcharomyces cerevisiae містить 1,4·10⁷ п.н., що приблизно в три рази більше, ніж геном Е.соlі. У цього виду в гаплоїдних клітинах міститься 17 хромосом. Відома єдина дріжджова кільцева дволанцюгова плазміда довжиною 6318 п.н. Вона містить ділянку реплікації ДНК ori і гени rep 1, rep 2 і rep 3, які забезпечують утворення до 50 копій плазміди на дріжджову клітину. Приблизно 50% плазмідної ДНК необхідно для її реплікації і збереження в клітинах, інші 50% несуттєві і можуть бути замінені на чужорідні фрагменти. Ця плазміда використана для створення човникового вектора.

Трансформація ДНК у дріжджові клітини досить ефективна. Для цього целюлозну клітинну стінку дріжджів видаляють ферментами, отримуючи сферопласти. Їх інкубують з ДНК у присутності поліетиленгліколю за високих концентрацій СаС1₂. В цих умовах мембрана стає проникливою для ДНК. Клітинна стінка на сферопластах відновлюється спонтанно. Відбираються трансформанти завдяки тому, що вони разом з векторною ДНК отримують необхідну ознаку і на відміну від нетрансформованих клітин здатні утворювати колонії на збіднілому живильному середовищі.

Переваги дріжджових клітин для генетичної інженерії полягають не лише в тому, що вони є еукаріотичними і містять необхідний апарат для експресії еукаріотичних генів, але й тому, що вони секретують велику кількість білків у живильному середовище.

Серед векторів для переносу чужорідних генів у дріжджі використовуються наступні.

Інтегративні плазміди дріжджів (YІ_р). Інтегративні плазміди – найпростіші вектори для даної систематичної групи. Вони представляють собою похідні бактеріальних плазмід, в які вставлені певні послідовності дріжджової ДНК, зокрема селективні дріжджові маркерні гени, а також клонований цікавлячий нас ген. При трансформації дріжджових клітин ці плазміди повністю або частково вбудовуються у дріжджові хромосоми. Вбудовування відбувається або за рахунок гомологічної рекомбінації з резидентним геном, або за рахунок одинарного чи подвійного перехресту. Як наслідок, або ціла плазміда встроюється у хромосому дріжджів, або резидентний алель заміщується алелем плазміди. Останнє явище є прикладом генного заміщення. Генне заміщення може бути використане для видалення гена або заміни мутантного алеля на дикий та навпаки. Такі заміщення виявляються при культивуванні на селективному середовищі для маркерного алеля плазміди.

Оскільки бактеріальні плазміди не реплікується у дріжджах, для стабільної генетичної модифікації генотипу реципієнта вони повинні бути вбудовані у дріжджову хромосому.

Епісомні плазміди дріжджів (YЕ_р). Деякі дріжджові штами природно вміщують кільцеву плазміду довжиною 6300 п.н., яка живе у ядрі і розщеплюється у дочірні клітини в мітозі і мейозі. Довжина окружності цієї плазміди у мікронах становить 2 мкм, тому її ще називають 2-мікронною плазмідою. Якщо сторонній (бактеріальній) плазміді, що несе трансген, передати оріджин реплікації від 2-мікронної плазміди, така плазміда зможе реплікуватися як додаткова молекула ДНК у ядрі. Цей тип плазміди називається епісомна плазміда дріжджів (YЕ_р). YЕ_р часто може рекомбінувати з YI_р. Деякі YЕ_р окрім дріжджового несуть ще і бактеріальний оріджин реплікації. Такі різновиди YЕ_р виступають як цінні човникові вектори і можуть функціонувати у клітинах різних видів.

Штучні хромосоми дріжджів (YАС). Штучна хромосома дріжджів представляє собою плазміду, переведену у лінійний стан, до якої додані центромера, оріджин реплікації та теломери. Така хромосома в мітозі поводить себе як маленька дріжджова хромосома і забезпечує розщеплення за генами, що в ній розташовані, як природні хромосоми дріжджів. Детальніше штучні хромосоми дріжджів вже розглядалися у розділі, присвяченому векторам для клонування.

ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ РОСЛИН

Існує два основних способи перенесення сторонньої ДНК у рослинну клітину: агробактеріальна трансформація і біолістика.

Агробактеріальна трансформація рослин основана на використанні грамнегативних бактерій роду Agrobacterium (родина Rhizobiaceae, відділ Gracilicutes) – широко розповсюджених ґрунтових бактерій. Цей спосіб перенесення ДНК у рослину є найбільш ефективним для дводольних рослин, хоча в останні роки були здійснені успішні спроби адаптувати цей метод для застосування на однодольних. До участі у генетичній трансформації зазвичай залучаються два види агробактерій - A. tumefaciens та A. rhizogenes.

В природних умовах контакт рослини з агробактеріями найчастіше відбувається при попаданні ґрунту на раневу поверхню стебла чи іншої частини рослини.

A. tumefaciens викликає у рослин захворювання, яке має назву „корончаті гали” або „корончатогалова пухлина”. Рослинні клітини в місці контакту з A. tumefaciens починають швидко та неорганізовано рости, що призводить до виникнення пухлини. Клітини пухлини синтезують специфічні речовини – похідні аргініну, які відносяться до групи опінів. Агробактерії використовують опіни для свого живлення. Кожен штам A. tumefaciens синтезує свій специфічний тип опінів - агропін, октопін, нопалін та інші.

A. rhizogenes викликає у рослин захворювання, яке називається „бородавчасті корені” та проявляється у розвитку тонких коренів, що звисають з гілок рослини у місці контакту з бактеріями. Ці корені також продукують опіни - маннопін, агропін, кукумопін.

Встановлено, що рослинні клітини зберігають всі ознаки хвороби і після вилучення агробактерій з ураженої ділянки. Цей факт призвів до думки, що має існувати інфікуючий фактор, який переходить від агробактерій до рослини. Цим фактором для обох видів бактерій виявилася велика Ti-плазміда, частину якої агробактерія за попадання на раневу поверхню ураженої рослини переносить в геном рослинної клітини. Структура Ті-плазміди октопінового та нопалінового штамів A. tumefaciens добре вивчена. Та частина Ti-плазміда, яка переноситься до геному рослинної клітини, називається Т-ДНК. Т-ДНК у складі Ті-плазміди фланкована (оточена) правим (RB) та лівим (LB) повторами з 24-25 пар нуклеотидів і може бути представлена в плазміді однією (нопалінові штами) або двома (октопінові штами) ділянками. У разі двох ділянок Т-ДНК поділяють на лівий район (TL) та правий район (TR). Ті-плазміда містить також важливі локуси: локус оri (ориджин реплікації), який забезпечує початок процесу реплікації плазміди; Vir-район, який відповідає за вірулентність і приймає участь у забезпеченні переносу Т-ДНК в геном рослинної клітини; Tra (Сon) – область, яка контролює функцію кон’югації; гени утилізації опінів.

У складі Т-ДНК Ті-плазміди A. tumefaciens ідентифіковано низку генів, які виявляються незалежно від різновиду штаму цієї бактерії. В цілому виявлено наступні гени Т-ДНК, які відповідать за синтез і секрецію фітогормонів, опінів та морфологію пухлини.

Ген 1 (iaa M 1 ) кодує фермент триптофан-2-монооксигеназу, яка каталізує синтез індолілацетаміду з триптофану.

Ген 2 (iaa H 2 ) кодує синтез гідролази, яка синтезує з індолілацетаміду фітогормон класу ауксинів індолил-3-оцтову кислоту.

Спільна дія генів 1 та 2 обумовлює збільшення вмісту ауксинів в рослинних клітинах.

Ген 3 кодує фермент біосинтезу опінів. Залежно від штаму це нопалін- або октопінсинтетаза.

Ген 4 (ipt) кодує ключовий фермент біосинтезу природних цитокінінів ізопентеніладенінтрансферазу.

Таким чином, гени 1, 2 та 4 є онкогенами, так як вони відповідають за синтез фітогормонів класів ауксинів та цитокінінів, які індукують поділ клітин.

Ген 5 кодує фермент, що бере участь в утворенні індоліл-молочної кислоти. Цей метаболіт є продуктом перетворення ауксину та інгібітором ауксинової дії. Його промотор є тканиноспецифічним, він спрацьовує лише в тканинах та неактивний у рослинах-регенерантах.

Ген 6а (tml 6а ) контролює секрецію опінів нопаліну та октопіну.

Ген 6б (tml 6б ) виконує тонку регуляцію дії цитокінінів на рослину. Його промотор є органоспецифічним і індукується за присутності ауксину, а також при ушкодженні рослинної тканини. Продукт гена змінює чутливість рослинних тканин до цитокініну та зберігає клітини у недиференційованому стані. Тобто ген 6б бере участь у пригніченні диференціювання та стимулює клітинні поділи.

Таким чином, гени 1, 2, 4, 5 та 6б відповідають за пухлинний ріст, а гени 3 та 6а контролюють синтез та секрецію опінів.

Повтори з 24-25 пар нуклеотидів, які фланкують Т-ДНК, є прямими та недосконалими (неповними, виродженими). Вони відігріють важливу роль в інтеграції Т-ДНК в геном рослинної клітини. Делетування лівої фланкуючої Т-ДНК ділянки не змінює процес утворення пухлини на рослині, видалення ж правої фланкуючої ділянки призводить до втрати вірулентності, зокрема до втрати здатності Т-ДНК включатися в рослинну ДНК. Будь-який сегмент ДНК, вбудований між фланкуючими повторами, може бути перенесений в рослинну клітину як частина Т-ДНК.

Особливої уваги заслуговує механізм переносу Т-ДНК у рослинну клітину. Вважається, що специфічність щодо вбудовування Т-ДНК в геном рослинної клітини відсутня, і Т-ДНК може вбудовуватися в будь-яку хромосому і будь-яку ділянку на хромосомі, але переважно у райони з підвищеною транскрипційною активністю. Процес переносу Т-ДНК у рослинну клітину можна поділити на наступні етапи: прикріплення агробактерії до рослинної клітинної стінки, проникнення Т-ДНК усередину рослинної клітини, інтеграція Т-ДНК в геном рослини та експресія генів Т-ДНК.

Бактерії прикріплюються до рослинних клітин в місцях пошкодження. Сайтами зв’язування на поверхні бактерій, як вважають, є молекули β-глюкана та О-антигенного ланцюгу ліпополісахариду зовнішньої мембрани.

У прикріпленні агробактерії до рослинної клітинної стінки суттєву роль відігріють гени chv A, chv B та psc A, розташовані на бактеріальній хромосомі. Ген chv B кодує білок, який приймає участь у синтезі циклічного β-1,2-глюкана – ключового фактору у прикріпленні агробактерій до рослинної клітинної стінки. Ген chv B відповідальний за синтез транспортного білка, локалізованого на внутрішній бактеріальній мембрані, який транспортує β-1,2-глюкан назовні клітини. Ген psc A також приймає участь у синтезі β-1,2-глюкана та ще однієї речовини, важливої для прикріплення – білка рикадгезину.

Бактерії зв’язуються з рецепторами клітин вищих рослин, які складаються з білка і пектину. Бактеріальні сайти зв’язування і рецептори рослин є конститутивними, тобто обидва партнери володіють ними ще до моменту взаємодії. Перший крок взаємодії з рослиною – пізнавання - слід розглядати як специфічну адгезію. Як тільки бактерії прикріпилися до поверхні клітин рослин, вони починають утворювати целюлозні фібрили. Ці фібрили можна побачити у скануючий електронним мікроскоп вже через 90 хвилин після додавання бактерій до суспензії культури клітин тканин моркви. За 10 годин інкубації фібрили формують сітку, яка вкриває поверхню рослинних клітин. Фібрили слугують більш міцному закріпленню бактерій на поверхні клітин хазяїна. За целюлозні фібрили можуть зачепитися вільно плаваючі клітини бактерій. Фіксуючи їх біля поверхні рослини фібрили збільшують зараження. В результаті розмноження утворюються накопичення бактерій на поверхні рослини.

Клітинна стінка рослини ушкоджується внаслідок виділення бактеріями пектолітичних ферментів, що забезпечує тісний контакт бактерій з плазмалемою рослинної клітини. Цей контакт необхідний для передачі ДНК від бактерій в рослинну клітину. Передача ДНК відбувається без порушення цілісності мембрани рослинної клітини, але потребує певного її стану – компетентності.

Індукція початкових етапів агробактеріальної трансформації може відбуватися лише у місці раневого пошкодження рослини, де виділяються атрактанти - низькомолекулярні сполуки ацетосирінгон, глюкоза, глюкуронова кислота, де виникає кислий рН. Процес вирізання та інтеграції Т-ДНК в рослинну хромосому здійснюють продукти генів, локалізованих у Vir-районі Ті-плазміди. На Vir-районі розташовані 8 оперонів (24 гени) – virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, virH. Усі ці оперони, за виключенням virA та virG не залучаються до транскрипції без взаємодії з відповідними індукторами – ацетосирінгоном, гідроксі-ацетосирінгоном, попередниками лігніну. Активація генів vir -району цими фенольними сполуками відбувається при їх взаємодії з продуктами оперонів virA та virG. Активність vir- району призводить до утворення однониткових молекул Т-ДНК Специфічна ендонуклеаза, яку кодує ділянка оперону virD, вирізає Т-ДНК з плазміди. Для транспортування Т-ДНК з бактеріальної до рослинної клітини необхідні білки VirB і VirE. Вважають, що перенесення Т-ДНК відбувається подібно до кон’югативного переносу ДНК у бактерій.

Проникнення Т-ДНК у рослинний геном відбувається поступово. В геном рослини можуть вбудовуватися декілька копій Т-ДНК. Т-ДНК транскрибується в рослинних клітинах РНК-полімеразою ІІ рослини-хазяїна, транскрипти мають особливості еукаріотичних матриць. Сама бактеріальна клітина в рослинну клітину не проникає, а лишається у міжклітинному просторі. Вона використовує рослинні клітини з вбудованою Т-ДНК як фабрику для виробництва опінів – джерела нітрогену та карбону, необхідних для бактеріальної клітини.

Т-ДНК Ті-плазміди є майже ідеальним вектором для введення сторонніх генів в геном рослинної клітини через широке коло хазяїв агробактерій та спосіб успадкування. Інтегрована у геном рослини Т-ДНК успадковується як проста домінантна ознака за законами Менделя, а її гени мають власні промотори, під контролем яких можуть експресуватися вставлені в Т-ДНК сторонні гени.

Для використанні в генній інженерії рослин Т-ДНК вирізають з Ті-плазміди за допомогою рестриктаз та вбудовують в один зі стандартних плазмідних векторів для розмноження в клітинах E. coli - плазміду E. coli рВR322, здатну до автономної реплікації, яка забезпечує клонування сегменту Т-ДНК. Бактерії, які містять плазміду рВR322 з ділянкою Т-ДНК, розмножують, після чого цю плазміду виділяють. Потім за певною методикою, з використанням рестриктаз у Т-сегмент вбудовують цільовий ген. Отриманий молекулярний гібрид знову розмножують в клітинах кишкової палички, а потім вводять у клітини агробактерії, яка несе відповідну повну Ті-плазміду. В результаті гомологічної рекомбінації між Т-сегментами нативної і сконструйованої Ті-плазміди Т-ДНК з вбудованим стороннім геном включається в Ті-плазміду, заміщуючи нормальну Т-ДНК. Таким чином, отримують клітини A. tumefaciens, які несуть Ті-плазміду з вбудованим у Т-ДНК цільовим геном. Далі рослинні тканини або ізольовані клітини інфікують цими генетично-модифікованими агробактеріями шляхом кокультивування (спільного культивування на живильному середовищі). Агробактерії передають у рослинний геном Т-ДНК з вбудованим цільовим геном, і рослинні клітини, тканини і регенеровані з них цілісні рослини стають генетично модифікованими.

Для спрощення наведеної вище процедури запропоновано використовувати так звані бінарні вектори. Для цього клітина агробактерії повинна містити як найменше дві різні модифіковані Ті-плазміди. Одна з них, плазміда-помічник, повинна містити тільки Vir-район, гени якого будуть приймати участь у вирізанні Т-ДНК. Інша Ті-плазміда повинна містити сегмент Т-ДНК з вбудованим цільовим геном. Продукти vir -генів здатні вирізати Т-ДНК як на власній плазміді, так і на сусідній, тобто vir -гени можуть працювати незалежно від їх місцерозташування. Таким чином, якщо агробактерії містять Ті плазміду з областю Vir та іншу плазміду з Т-ДНК, до якої вбудований цільовий ген, ці бактерії будуть трансформувати клітини рослин.

Векторна система на основі Ті-плазміди повинна містити усі сигнали, необхідні для транспорту та стабільної інтеграції у ядерну ДНК рослин, систему для експресії сторонніх генів в рослинах, зокрема, промотор, який буде розпізнаватися рослинними ДНК-залежними РНК-полімеразами, маркерний ген, необхідний для селекції трансформованих клітин. Ця система також не повинна містити онкогенів, які пригнічують диференціацію. Інактивація онкогенів виконується за допомогою транспозонового мутагенезу. Так, в результаті введення транспозона (послідовності ДНК, яка здатна переміщуватися по геному) в Т-ДНК можливо виключити гени, які викликають пухлино утворення. Зазвичай використовують бактеріальні транспозони Tn5 та Tn7. В процесі підготовки Ті-плазміди треба передбачити також наявність унікальних сайтів рестрикції для вбудовування стороннього фрагменту ДНК. Такі унікальні сайти створюються включенням в штучні Ті-конструкції послідовностей з численними сайтами рестрикції для рестриктаз Eco R1, Hind III, Bam H1та інших. В деяких випадках множинний сайт є полілінкером, оскільки має до 20 сайтів рестрикції для різних рестриктаз.

Дуже важливо при конструюванні векторів на основі Ті-плазмід підібрати такі промотори, які забезпечать експресію трансгена в рослинах. Для цього промотор повинен бути сильним, тобто забезпечувати активну експресію, бути здатним до регуляції, забезпечувати тканино- та органоспецифічну експресію. Найбільш популярним у сучасній генетичній інженерії рослин є промотор гена вірусу мозаїки кольорової капусти (CAMV).

Введення сторонніх генів у рослинні клітини у складі векторних конструкцій окрім агробактеріальної методики може відбуватися шляхом електропорації, використання карбідних та силіконових фібрил, поліетиленгліколю. Ці методичні прийоми забезпечують утворення у клітинних стінках і плазматичних мембранах отворів, через які плазміди проникають в рослинну клітину. Але найбільш поширеним і ефективним у теперішній час є метод перенесення сторонніх генів в геном рослинних клітин, запропонований у 1987 році Джоном Санфордом, який називається біолістика (біологічна балістика, мікробомбардування). Біолістика ґрунтується на механічному перенесенні плазмідної ДНК, сорбованої на мікрочастинках твердої речовини (золота, вольфраму, платини) діаметром 0,6 – 1,2 мкм, котрі розганяються до значних швидкостей у генній гарматі, як правило, в атмосфері гелію. Ці мікрочастинки спрямовують на клітини чи тканини рослинного об’єкта. Обстріл мікрочастинками призводить до проникнення плаз мідної ДНК усередину рослинної клітини. В рослинній клітині чужорідна ДНК вбудовується в хромосоми випадковим порядком і успадковується за законами класичної генетики. Особливо зручний метод біолістики для рослин, які погано піддаються агробактеріальній трансформації, зокрема, для злаків.

Для агробактеріальної трансформації найчастіше використовують листкові диски та калусні культури, тоді як для біолістики коло рослинних об’єктів для перенесення сторонніх генів розширене і включає калуси, суспензійні культури, молоді зиготичні зародки, ембріоїди, незрілий пилок та інші.

Треба відмітити, що останнім часом все більше уваги привертає на генетична модифікація не тільки ядерної, але і хлоропластної ДНК рослин. Стабільна трансформація хлоропластів вперше була проведена у 1988 році у зеленої водорості Chlamydomonas reinhardtii, потім була повторена для тютюну та арабидопсису. У теперішній час більше 40 трансгенів стабільно інтегровані і експресовані в хлоропластний геном тютюну. Для трансформації хлоропластів застосовують обробку листкових дисків плаз мідною конструкцією з рекомбінантною ДНК. До переваг хлоропластної трансформації за M. Y. Khan et al. (2009) належать відсутність ризику щодо трансмісії трансгена з пилком до інших рослин, відсутність “мовчання” трансгена, краща експресія бактеріальних генів хлоропластами, ніж генами ядра. Транс гени, інтегровані в хлоропласт ний геном, показують дуже віскі рівні експресії – до 40 % розчинного протеїну клітини складають рекомбінантні білки.

Дата добавления: 2014-01-05