Селекція генетично-модифікованих клітин

В результаті трансформації чи трансфекції утворюються популяції різних клітин чи бактеріофагів. Одні члени популяції містять необхідні рекомбінантні молекули, інші представляють собою незмінені (нетрансформовані) клітини. Крім того, можуть зустрічатися клітини, які містять дві або більше вставок чужорідних фрагментів, чи в результаті рекомбінації в клітині-хазяїні чужорідний фрагмент змінюється. Тому, після трансформації клітин рекомбінантними ДНК потрібно здійснити клонування та добір необхідного клону рекомбінантних клітин.

Необхідною умовою для клонування певних рекомбінантних ДНК є можливість розділення всіх трансформованих клітин. Лише у цьому випадку кожен клон буде представлений окремою колонією бактеріальних клітин і містити певну рекомбінантну ДНК. Для клонування клітин, трансформованих рекомбінантними ДНК з плазмідними векторами, останні після трансформації висівають на агари зоване живильне середовище таким чином, щоб клітини були повністю ізольовані одна від іншої і кожна могла давати початок окремій колонії. Оскільки вектор містить хоча б один селективний маркер, то на селективному середовищі розмножуються і утворюють клони лише трансформовані клітини. Нетрансформовані клітини не містять селективного маркера, а тому гинуть.

Для клонування клітин, інфікованих фаговими частинками, їх висівають на газоні чутливих клітин, на якому в результаті інфікування сусідніх клітин, утворюються фагові бляшки. Деякі фагові вектори мають вбудовані маркери, які дозволяють здійснювати добір рекомбінантів серед інтактних векторів без чужорідних фрагментів ДНК.

Після отримання окремих клонів клітин потрібно ідентифікувати ті клітини, які містять рекомбінантні ДНК. Спосіб ідентифікації повинен бути якомога простішим і надійним, оскільки перевіряти потрібно величезну кількість клітин.

Більшість клітин після проведення трансформації не містять рекомбінатної ДНК. У деяких з них з'являється кільцева плазмідна ДНК, в інших – неплазмідна ДНК і лише в окремих клітинах – плазміда з вбудованим чужорідним геном – гібридна плазміда (рекомбінантна ДНК).

Як відомо, нехромосомна ДНК, яка не містить точки початку реплікації, не може реплікуватися у бактеріальній клітині. Таким чином, проникнення у клітину екзогенної ДНК ще не означає, що вона буде зберігатися і підтримуватися у клітинах під час їх поділу. Крім того, для збереження рекомбінантної ДНК у клітині-хазяїні необхідно, щоб в останній були відсутні гени, що кодують рестриктази, здатні здійснювати деградацію ДНК.

Після виділення, клонування та ідентифікації необхідної нуклеотидної послідовності ДНК проводиться модифікація генотипу організму-реціпієнта чужорідною послідовністю ДНК. Процес перенесення і встроювання чужорідного гена в геном реципієнта – важливий етап генетично-інженерних маніпуляцій. Ген, що переноситься, називається трансгеном. Організм, в геном якого перенесено трансген, називається трансгенним організмом або генетично-модифікованим організмом.

Методики перенесення, вбудовування чужорідної ДНК та забезпечення її експресії різняться в залежності від систематичної приналежності організму-реципієнту. Розглянемо особливості трансгенезу у основних груп організмів – бактерій (прокаріоти) та грибів, рослин і тварин (еукаріоти).

Дата добавления: 2014-01-05