Комплементарна ДНК (кДНК) – це дволанцюгова ДНК-версія молекули мРНК, отримана за допомогою ферменту зворотної транскриптази

Фермент зворотна транскриптаза за механізмом дії є РНК-залежною ДНК-полімеразою, біологічна роль якої полягає в утворенні ДНК-копій геномів деяких РНК-вміщуючих вірусів. Одержання копії структурної частини гена з певної мРНК ведуть у дві стадії: синтезують спочатку однониткову, а потім двониткову кДНК. На першій стадії як праймер використовують олігонуклеотид (dT)_n, який гібридизується з поліадениловим ланцюгом на 3'-кінці мРНК. Олігонуклеотид повинен вміщувати не менше 12 ланок, щоб забезпечити стабільність дуплексу у відповідних умовах реакції.

За допомогою зворотної транскриптази можна синтезувати копію будь-якої частини мРНК підібравши придатний праймер. Ця можливість полегшує аналіз будови певної специфічної ділянки гена. Можна одержати і набір генних фрагментів, якщо використовувати у якості праймерів довільні олігонуклеотиди, які одержують, наприклад, в результаті гідролізу ДНК тимусу теляти панкреатичною ДНКазою. Їх різноманітність настільки велика, що серед них є комплементарні послідовності до будь-якої з ділянок мРНК (або ДНК). Додавання до реакційної суміші сумарної фракції таких праймерів дає змогу одержати у наборі кДНК копії всіх ділянок гена, що аналізується. Вони є корисними для використання у якості гібридизаційних зондів, які використовуються для пошуку певних клонів у банках генів.

Хімічно синтезована ДНК – це ділянка ДНК, яка представляє собою ген, штучно синтезований завдяки хімічним реакціям. Хімічно синтезувати можна лише ген, нуклеотидна послідовність якого відома. Вперше хімічний синтез полінуклеотидів був здійснений Х. Г. Кораною. В 1979 році він синтезував ген тРНК, що складався з 207 нуклеотидів. Даний процес у теперішній час повністю автоматизований. Синтез генів здійснюється у приладах, які називаються синтезатори. Шляхом хімічного синтезу отримують одноланцюгові полінуклеотиди. На їх основі за допомогою ДНК-полімеразної реакції утворюють дволанцюговий ген.

ВИБІР ТА ПІДГОТОВКА ВЕКТОРНОЇ ДНК ДЛЯ КЛОНУВАННЯ

У широкому розумінні вектор або векторна ДНК – це автономна (від хромосоми або хромосом) молекула ДНК, наприклад, бактеріальна плазміда, яка використовується у генетичній інженерії для перенесення генів від організму-донора в організм-реципієнт, а також для клонування нуклеотидних послідовностей. Основною властивістю вектора є наявність сайту для встроювання чужорідного полінуклеотида.

Для отримання рекомбінантної ДНК треба поєднати донорну ДНК з векторною, причому остання повинна забезпечити успіх перенесення донорної ДНК до реципієнтної клітини та розмноження шляхом клонування. Функцію перенесення генів від одного організму до іншого та функцію клонування може виконувати одна і та ж сама молекула векторної ДНК або різні вектори. При виборі векторної молекули ДНК для клонування необхідно враховувати наступні вимоги:

1) векторні ДНК повинні бути малими молекулами для зручності маніпуляції;

2) векторні ДНК повинні бути здатними до реплікації у живій клітині для ампліфікації вбудованого в них фрагмента донорної ДНК;

3) векторні ДНК повинні мати зручні сайти рестрикції для встроювання фрагмента ДНК, що клонується або переноситься. Краще за все, якщо сайт рестрикції буде зустрічатися у векторній ДНК лише один раз, щоб фрагмент донорної ДНК вбудовувався лише в одне місце на векторній ДНК;

4) векторні ДНК повинні забезпечувати швидкий шлях для ідентифікації рекомбінантних молекул.

Усі існуючі нині вектори можна класифікувати за певними ознаками.

За структурою ДНК розрізняють: 1) кільцеві вектори; 2) лінійні вектори.

За способом підтримання у клітині вектори поділяють на: 1) автономні (реплікуються самостійно); 2) інтегративні (реплікуються у складі хромосоми).

За кількістю молекул у клітині вектори поділяються на: 1) малокопійні; 2) мультикопійні.

За кількістю реплікаторів у векторному геномі вектори поділяються на: 1) монорепліконні; 2) бірепліконні.

Дуже важливою є класифікація векторних ДНК за походженням. З походженням векторів пов’язана успішність клонування вставок ДНК різного розміру та різноманітне подальше використання клону. За цією класифікацією векторні ДНК поділяються на наступні класи.

1. Плазмідні вектори. Плазміди – це невеликі дволанцюгові молекули ДНК (1-200 тис.п.н. – 1-3% клітинного геному), які оснують позахромосомно та здатні до довготривалого автономного існування. У генетичній інженерії, зазвичай, використовують бактеріальні плазміди. Плазміди бактерій мають кільцеву форму і представляють собою один реплікон. Як вектори використовують плазміди, які несуть гени стійкості до лікарських препаратів. Ці гени забезпечують можливість проведення селекції клітин, трансформованих плазмідами: клітини, які залишаються живими після дії селективного фактора, наприклад, після обробки лікарськими препаратами, повинні нести плазмідні вектори зі вставкою донорної ДНК. Плазміди бактерій становлять дуже ефективний засіб ампліфікації фрагмента донорної ДНК, так як вони присутні у клітині у великій кількості копій (інколи до декількох сотень ). Плазмідні вектори підходять для клонування вставок донорної ДНК розміром 25-30 тис.п.н. Однією з перших плазмід, застосованих у якості багатоцільового вектора для клонування Ф. Боліваром із спів. у 1977 році, була плазміда E.coli pBR322. Вона вміщує декілька зручних сайтів рестрикції, а також гени стійкості до ампіциліну та тетрацикліну. Наявність такої пари генів дозволяє одночасно ідентифікувати бактерію – носія плазміди та відрізняти химерну плазміду від батьківської.

Для клонування у клітинах E.coli можуть використовуватися наступні плазмідні вектори.

Плазміда pSC101. Ця плазміда має розмір 9,1 тис.п.н., малокопійна та містить ген стійкості до тетрацикліну. Плазміда та її похідні використовуються для клонування генів, продукти яких у великій кількості призводять до серйозних порушень нормального клітинного метаболізму.

Плазміда ColE1 є мультикопійною. Бактеріальні клітини, трансформовані цією плазмідою, пізнають за стійкістю до коліцину, обумовленою геном imm, а клони з рекомбінантною ДНК відрізняють за відсутністю в них синтезу коліцину.

Плазміда pBR322 містить 4361 п.н. та широко використовується у лабораторній практиці. Він містить реплікатор плазміди pMB1 (споріднена до плазміди ColE1 та несумісна з нею), від неї має ознаку багатокопійності (15-20 копій на клітину) та здатність до ампліфікації в присутності хлорамфеніколу. Дана плазміда володіє стійкістю до тетрацикліну та ампіциліну. На основі даної плазміди сконструйовано багато похідних векторів для експресії генів і секреції білків, прямої селекції рекомбінантних ДНК, ідентифікації регуляторних сигналів та ін.

Плазмідні вектори серії pUC призначені для клонування та експресії генів, їх копійність сягає 500 на клітину. Селективною ознакою для відмінності вектора від рекомбінантної ДНК служить Lac-фенотип реципієнтних клітин.

Плазміда P15A виділена зі штаму E.coli 15, відноситься до ColE1 – типу репліконів, але сумісна з іншими плазмідами цього типу. Це дозволяє використовувати її для спільної трансформації з іншими плазмідами, наприклад, з плазмідою pBR322. Системи з двох векторів зручні для регуляції експресії гена, що клонується, оскільки дозволяє розташувати структурний та регуляторний гени на різних плазмідах. Сама плазміда P15A не додає клітинам певного фенотипу, тому при конструюванні векторів до її реплікатора приєднують фрагменти ДНК, які містять селективні маркери.

Вектори pGEM. Згадані вище вектори придатні лише для клонування генів в клітинах E.coli та інших грамнегативних бактерій. Вони є універсальними і їх використовують для різнорідних цілей. У той же час сконструйовано багато спеціальних векторів, придатних, наприклад, тільки для ідентифікації регуляторних сигналів, для суперпродукції чужорідних білків та їх секреції, для секвенування ДНК, експресії генів тварин в бактеріях. Сучасні вектори, які пропонуються фірмами, мають деякі особливості, зокрема, містять полілінкери, причому для зручності використання їх вводять у протилежних напрямках. Тобто, вектори випускають парними, що відображається на порядковому номері при їх назві. У векторів на кінцях полілінкерів містяться промотори фагів SP6, Т3 та/або Т7. Це дозволяє здійснювати транскрипцію клонованого гена in vitro в обох напрямах з метою використання транскриптів у якості гібридизаційних зондів або для транслювання в білок-синтезуючій системі. Прикладами саме таких векторів слугують вектори pGEM2 і pGEM2.

2. Фагові вектори. Бактеріофаги – це група вірусів, здатних розмножуватися лише в бактеріальних клітинах. Більшість фагів містить дволанцюгову ДНК як генетичний матеріал, хоча у деяких бактеріофагів цю функцію виконує одноланцюгова ДНК або одноланцюгова РНК. Бактеріофаг-вектор захоплює фрагмент донорної ДНК і включає його як вставку у свою молекулу ДНК, причому різні класи бактеріофагових векторів можуть нести вставки донорної ДНК різного розміру. Фагові вектори конструюють на базі ДНК фагів з таким розрахунком, щоб в них зберігалася інформація, яка забезпечує збірку фагових частинок in vivo. Для клонування у клітинах E.coli такі векторі розроблені на базі ДНК фагів λ та М13.

У першому випадку фагові головки мають строго визначену геометрію, так що вектори здатні включати таку кількість чужорідної ДНК, щоб рекомбінантні ДНК, що утворилися, могли упаковуватися в головки фага. З цієї причини вектори на основі фага λ характеризуються своєю ємністю. Бактеріофаг λ є одним з ефективних фагових векторів. Довжина його ДНК близько 50 тис.п.н. Він здатний бути вектором для клонування дволанцюгових ДНК-вставок довжиною 15 тис.п.н. Центральна частина геному фага λ не потрібна для реплікації та упаковки молекули ДНК фага і тому може бути видалена за допомогою ферментів рестрикції та замінена вставкою донорної ДНК. Довжина вставки має бути близько 10-15 тис.п.н. для збереження загального розміру ДНК фага λ у 50 тис.п.н. Після поєднання донорної ДНК та векторної ДНК бактеріофага рекомбінантні молекули можуть бути запаковані у головки фага in vitro і потім введені у бактерію або може бути проведена трансформація клітин E.coli такими рекомбінантними молекулами. Наявність фагових бляшок на бактеріальному газоні свідчить про присутність рекомбінантного фага.

Для нитковидних фагів, до яких відноситься М13, поняття ємності не може бути застосовано. Величина ДНК, що в них клонується, визначається вимогами експерименту до стабільності фагових частинок.

3. Гібридні вектори. Плазмідні вектори та вектори-бактеріофаги можуть акцептувати донорну ДНК розміром до 30 тис.п.н. Однак, у багатьох експериментах необхідні довші вставки донорної ДНК, для клонування яких були сконструйовані спеціальні вектори. Загальною їх властивістю є те, що після попадання у бактерію вони здатні реплікуватися як великі плазміди. Такими є косміди, фагміди, фазміди та інші вектори для клонування великих фрагментів ДНК.

Косміди - це плазмідні вектори, що містять cos-сайти фага λ для ефективної упаковки in vitro. Це вектори, які можуть нести вставки довжиною 35-45 тис.п.н. Вони представляють собою гібриди ДНК фага λ і бактеріальної плазмідної ДНК. Косміди упаковуються у частинки фага λ, які доставляють їх у реципієнтні клітини E.coli. Плазмідний компонент косміди забезпечує послідовність, необхідну для реплікації косміди. Потрапивши одного разу до клітини косміди формують кільцеві молекули, які здатні, як і плазміди, до автономної реплікації. Косміди призначені для конструювання банків генів.

Фагміди – це плазмідні вектори, які вміщують ori -сайт нитковидних фагів. У присутності фагів f1 або M13 фагміди, використовуючи сайт ori (+), починають реплікуватися як фагові ДНК і утворюють однониткові копії плазмід, причому вибір нитки для копіювання залежить від орієнтації ori -сайту. Однолагцюгові ДНК, що утворилися, можуть упаковуватися in vivo в капсулу і одночасно з фагом-помічником покидати природним шляхом клітину.

Фазміди – є справжніми гібридами між плазмідами і фагом. Це лінійні дуплексні молекули ДНК, кінці яких представляють собою фрагменти ДНК фага λ, які містять всі гени, необхідні для літичної інфекції. Середня частина фазміди є плазмідною у лінійному стані. Такий вектор містить декілька тандемних повторів плазмідного компонента, що забезпечує необхідний розмір для упаковки ДНК у фагову головку. Ці повтори можуть бути замінені на чужорідні фрагменти ДНК. Рекомбінантні ДНК на основі фазмід здатні упаковуватися у фагові головки з наступним інфікуванням клітин Е.соlі. В клітинах фазміди можуть реп лікуватися як фагові ДНК і здійснювати свій подальший розвиток літичним шляхом. Якщо ж вектор містить ген, який кодує репресор фага λ, то тоді фазміда реплікується як плазміда, а не як фаг.

Штучна хромосома P1 (PAC) – це вектор, подібний до космід, але створений при поєднанні ДНК бактеріофага Р1 та бактеріальної плазмідної ДНК. Геном бактеріофага Р1 більший за геном фага λ, тому РАС може акцептувати вставки 80-100 тис.п.н.

Штучна хромосома бактерій (BAC) – вектор, що походить від F-плазміди бактерій, може нести вставки довжиною 150-300 тис.п.н. BAC, яка вміщує вставку донорної ДНК, вводиться у бактерію шляхом специфічної трансформації. BAC-вектори використовуються для природного клонування в великомасштабних проектах із геномного секвенування.

Штучна хромосома дріжджів (YAC) – еукаріотична векторна система для клонування вставок донорної ДНК довжиною більше, ніж 300 тис.п.н. Прикладом такої вставки може служити ген людини, який викликає спадкове захворювання – м’язову дистрофію Дюшена і має довжину більше, ніж 1000 тис.п.н. Штучна хромосома дріжджів представляє собою плазміду бактеріального походження, якій надана лінійна форма і до якої приєднана хромосомна центромера дріжджів, теломерна ДНК дріжджів і оріджини реплікації дріжджів (“послідовності, що автономно реплікуються”).YAC створюються, зазвичай, на основі ДНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae і поводять себе у мітозі і мейозі як невеликі дріжджові хромосоми. Інші вектори, які використовуються для дріжджів, будуть розглянуті в розділі, присвяченому генетичній інженерії грибів.

Човникові вектори. Плазміди і бактеріофаги часто реплікуються в клітинах лише одного чи невеликої кількості видів. Створені човникові вектори, які здатні реплікуватися в клітинах різних видів. Човникові вектори містять дві ділянки ініціації реплікації оrі, що відповідають кожному з двох видів організмів. Такі вектори для різних цілей конструюють за допомогою методів створення рекомбінантних ДНК. Одні з них здатні існувати поперемінно в клітинах різних видів прокаріот, інші – в прокаріотичних (звичайно в Е.соlі) і еукаріотичних клітинах (дріжджових, рослинних чи тваринних). Більшість створених еукаріотичних векторів є човниковими. Основне призначення човникових векторів полягає в тому, що в клітинах прокаріотів здійснюється розмноження (клонування) ДНК, після чого вони переводяться в еукаріотичні клітини, де забезпечується їх функціонування. Різноманітність векторів обумовлена їх специфічністю по відношенню до певних видів організмів.

ПОЄДНАННЯ ДОНОРНОЇ ТА ВЕКТОРНОЇ ДНК З УТВОРЕННЯМ РЕКОМБІНАНТНОЇ ДНК

Зазвичай, при одержанні донорної вставки та вектора геномна ДНК та плазмідна ДНК розрізаються одним і тим самим ферментом рестрикції, який продукує комплементарні “липкі” кінці. Найбільш простий і доступний метод з'єднання фрагментів ДНК – це віджиг фрагментів, отриманих після обробки ДНК тією рестриктазою, що утворює "липкі" комплементарні однониткові кінці. В результаті віджигу комплементарні кінці двох фрагментів - донорної та векторної ДНК - з'єднуються водневими зв'язками. Ковалентні 3', 5'-фосфодіефірні зв'язки між фрагментами утворюються ферментом ДНК-лігазою. ДНК-лігаза відновлює ковалентну безперервність ланцюгів ДНК. Фрагменти донорної та векторної ДНК змішують in vitro за відповідних фізіологічних умов, їх “липкі” кінці поєднуються, в результаті чого формуються рекомбінантні молекули ДНК.

ДНК-лігази відкриті в 1967 році. Добре вивчені ДНК-лігази бактеріофага Т-4 та Е. соlі. Ці ферменти найбільш ефективно з'єднують фрагменти ДНК з "липкими" кінцями. Однак, наявність "липких" кінців не є обов'язковою умовою для з’єднання фрагментів ДНК-лігазою. ДНК-лігаза фага Т-4 здатна з'єднувати і тупі двониткові фрагменти ДНК. Але, щоб ця реакція відбувалася ефективно, необхідна висока концентрація ДНК та значно більші (приблизно в 10 разів) концентрації ферменту. Цей процес прискорюється також, якщо в інкубаційне середовище крім ДНК-лігази додають РНК-лігазу фага Т-4.

Досить часто виникає необхідність з'єднати фрагмент ДНК, отриманий шляхом розщеплення однією рестриктазою, з вектором, який має сайт рестрикції, специфічний до іншої рестриктази. Щоб з'єднати два, отримані різними рестриктазами фрагменти ДНК з некомплементарними кінцями, використовують короткі синтетичні дволанцюгові олігонуклеотиди, які мають у своєму складі сайти впізнання необхідними рестриктазами. Такі олігонуклеотиди називають лінкерами. Лінкер повинен мати "липкі" кінці до обох фрагментів ДНК, які необхідно з'єднати, і утворює з ними водневі зв'язки. Далі лігаза каталізує утворення ковалентних міжнуклеотидних зв'язків між лінкером та фрагментами ДНК.

Якщо у якості донорної взято комплементарну ДНК (кДНК), яка не містить “липких” кінців, поєднання донора і вектора відбувається тільки за допомогою ДНК-лігази або до кожного кінця вектора і кДНК додаються “липкі” кінці.

Дата добавления: 2014-01-05